以雞胸軟骨為原料提取硫酸軟骨素的研究

李燕妮,曹紅光

(1.濱州醫(yī)學院藥學院，山東 煙臺264003；2.煙臺安德利果膠股份有限公司，山東 煙臺264000)

硫酸軟骨素是一種具有重復二糖單元結(jié)構(gòu)的粘多糖，這些二糖是硫酸化和/或未硫酸化的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺。軟骨的蛋白聚糖單體含80～100 個硫酸軟骨素鏈，它與連接蛋白和透明質(zhì)酸形成大而可逆壓縮的流體型聚集物，這些聚集物是軟骨能夠以最小變形來對抗大負荷必不可少的物質(zhì)。

臨床研究證明硫酸軟骨素治療骨關(guān)節(jié)炎有較好的療效[1]。在美國和歐洲，硫酸軟骨素不僅直接用作藥品[2]；還廣泛用于治療動物(如狗和馬)的關(guān)節(jié)炎；同時也是一種發(fā)展迅速的膳食補充劑。硫酸軟骨素的來源通常是牛氣管軟骨和鯊魚軟骨[3]，無法滿足迅速增長的需求，因此開發(fā)其它硫酸軟骨素來源非常重要。雞胸軟骨是一種有潛力的來源，不僅產(chǎn)量很大，且容易收集，便于生產(chǎn)加工。作者在此以雞胸軟骨為原料提取硫酸軟骨素，擬為拓寬硫酸軟骨素來源提供參考。

1 實驗

1.1 原料、試劑與儀器

雞胸軟骨。

木瓜蛋白酶、硼氫化鈉、軟骨素ABC酶、角質(zhì)素、角質(zhì)素酶、鯊魚硫酸軟骨素， Sigma公司。所用試劑均為分析純。

高速冷凍離心機，德國Heraeus公司；1260 Infinity型液相色譜儀，安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 硫酸軟骨素的提取

取雞胸軟骨勻漿后在60 ℃下用木瓜蛋白酶(用量為4 mg·g-1)水解3 h除去蛋白質(zhì)，為了水解徹底，再次加入木瓜蛋白酶(用量為4 mg·g-1)水解3 h。將水解液離心除去不溶物，在上清液中加入氯化鈉溶液(用量為20 mg·mL-1)，緩緩加入2 BV 95%乙醇沉淀多糖，靜置4 h，離心，收集沉淀的多糖，溶解后同法再次沉淀，用乙醇洗滌后烘干，測定硫酸軟骨素含量和蛋白質(zhì)含量。

用上述方法，分別處理不同生長時間的雞胸軟骨，每組平行測定3次，取平均值。

1.2.2 硫酸軟骨素的純化

為了除去從雞胸軟骨中提取的硫酸軟骨素糖鏈中殘余的氨基酸，先將5.0 g提取的多糖配制成1000 mL的溶液，然后加入終濃度為1 mol·L-1NaBH4作為保護劑，再加入終濃度為0.05 mol·L-1NaOH溶液，在45 ℃下堿解48 h[3]。用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5，乙醇沉淀，烘干，得硫酸軟骨素，用于硫酸軟骨素的鑒別。

1.3 檢測方法

采用《中國藥典》(2010版)方法測定硫酸軟骨素含量。

采用福林酚法測定蛋白質(zhì)含量。

采用色譜法和凝膠電泳法對硫酸軟骨素進行鑒別。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生長時間的雞胸軟骨提取硫酸軟骨素

取不同生長時間的雞胸軟骨提取硫酸軟骨素，結(jié)果見表1。

表1不同生長時間的雞胸軟骨中硫酸軟骨素的含量

Tab.1 The chondroitin sulfate content of the chicken keel cartilageat at different growth stages

由表1可知，由不同生長時間雞胸軟骨提取的多糖平均產(chǎn)量為41.2 mg·g-1，其中硫酸軟骨素、蛋白質(zhì)的平均含量分別為73.6%、3.6%，其余組分可能是硫酸鹽低聚糖或非硫酸鹽多糖等化合物。

2.2 硫酸軟骨素的鑒別

2.2.1 色譜分析

純化后的多糖采用MONO Q色譜柱測定其組分。為了鑒別從雞胸軟骨中提取的硫酸軟骨素，用軟骨素ABC酶和角質(zhì)素酶對多糖進行水解[2](因角質(zhì)素通常是和硫酸軟骨素共存的，所以選擇角質(zhì)素酶)。用軟骨素ABC酶水解時，樣品用軟骨素ABC酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液在37 ℃處理4 h。用角質(zhì)素酶水解時，樣品用含0.05 mol·L-1鹽酸三羥甲基氨基甲烷的角質(zhì)酶在37 ℃處理4 h。處理后樣品的色譜見圖1。

a.雞胸軟骨多糖 b.軟骨素ABC酶處理后的雞胸軟骨多糖 c.角質(zhì)素酶處理后的雞胸軟骨多糖 d.鯊魚硫酸軟骨素

由圖1可知，雞胸軟骨多糖提取物呈單一對稱峰，經(jīng)軟骨素ABC酶酶解后，該峰完全消失，而經(jīng)角質(zhì)素酶酶解后只是有所降低。這表明雞胸軟骨多糖主要是硫酸軟骨素。

2.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

為了驗證色譜分析的結(jié)果，將同法處理過的樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，緩沖溶液為0.1 mol·L-1硼酸-0.1 mol·L-1Tris-0.01 mol·L-1EDTA二鈉鹽溶液(pH值6.3)，結(jié)果見圖2。

a.雞胸軟骨多糖 b.軟骨素ABC酶處理后的雞胸軟骨多糖c.角質(zhì)素酶處理后的雞胸軟骨多糖 d.軟骨素ABC酶處理后的角質(zhì)素e.角質(zhì)素 f.角質(zhì)素酶處理后的角質(zhì)素

由圖2可知，雞胸軟骨多糖經(jīng)軟骨素ABC酶處理后，多糖色帶消失；經(jīng)角質(zhì)素酶處理后，色帶顏色稍淺。表明雞胸軟骨多糖主要是硫酸軟骨素,與色譜分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

以雞胸軟骨為原料，在60 ℃下用木瓜蛋白酶水解除去蛋白質(zhì)，再用乙醇沉淀獲得雞胸軟骨多糖。色譜分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別顯示，雞胸軟骨多糖主要是硫酸軟骨素，表明雞胸軟骨是可行的硫酸軟骨素新來源。

[1] Sato S,Rahemtulla F,Prince C W,et al.Proteoglycans of adult bovine compact bone[J].Connect Tissue Res,1985，14(1):65-75.

[2] Yamada Shuhei,Sugahara Kazuyuki.Potential therapeutic application of chondroitin sulfate/dermatan sulfate[J].Current Drug Discovery Technologies,2008,5(4):289-301.

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