抗人EGFR/抗CD3雙功能抗體的制備、檢測及對胃癌細胞毒性作用的實驗研究

張 林，侯艷紅，張 健，胡 靜，張 靜

1.解放軍第309醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100091;2.解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)教研室

近年來隨著腫瘤治療技術(shù)的不斷進步，分子靶向藥物的出現(xiàn)和大規(guī)模運用于臨床已成為人類腫瘤治療上新的希望。目前進入臨床治療胃癌的主要是EGRR單克隆抗體類藥物，在實際對胃癌患者的在治療中表現(xiàn)出一定的效果。雙特異性抗體(BsAb)是一種人工合成的具有同時識別并結(jié)合兩種無關(guān)抗原的單個抗體分子。利用雙功能抗體的橋接作用將體內(nèi)的T淋巴細胞等效應(yīng)細胞募集到腫瘤組織周圍起到良好的抑瘤作用，目前已有部分研究報道［1-2］。本研究旨在通過初步的化學(xué)合成抗EGFR/抗CD3雙功能抗體，并通過體外實驗初步驗證抗EGFR/抗CD3雙功能抗體對胃癌細胞的殺傷能力。

1 材料與方法

1.1 材料 胃腺癌細胞系SGC7901為解放軍總醫(yī)院老年消化病實驗室保存，抗人EGFR單克隆抗體、抗人CD3單克隆抗體均購自美國Abcam公司，N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸鹽(SPDP)、二硫基蘇糖醇(DTT)及MTT均購自美國Sigma公司。普通細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購自比利時 Orange公司，ThemoLabsystems酶標儀(美國Thermo Electron公司)，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡均購自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 抗EGFR/抗CD3雙功能抗體(BsAb)制備:采用化學(xué)耦連法按Chen等［3］步驟進行，抗人EGFR單抗和CD3單抗各取1 mg/mL分別在中性PBS緩沖液中于4℃透析10 h。取SPDP乙醇溶液，按8∶1比例分別加入抗人EGFR單抗和抗CD3單抗于透析袋中混勻，室溫反應(yīng)30 min，將抗人EGFR單抗以0.1 mol/L pH 4.5的醋酸鹽緩沖液透析，抗CD3單抗則以0.1 mol/L pH 7.5的PBS透析，每2.5 h換透析液1次，共換3次。取等體積經(jīng)處理的抗人EGFR單抗和抗CD3單抗，混合后加入適量DTT至終濃度50 mmol/L，室溫搖勻30 min，4℃下以PBS透析10 h，中間換透析液4次。8 000 r/min離心10 min，取上清，紫外分光光度計下測量蛋白濃度，25 μm濾膜除菌備用，SDS-PAGE法檢測抗體化學(xué)偶聯(lián)合成的效果。

1.2.2 雙功能抗體與SGC7901細胞及效應(yīng)細胞(人PBLS細胞)的結(jié)合活性:采用活細胞間接免疫熒光法檢測，以FITC標記的CD3分子標記檢測抗EGFR/抗CD3雙功能抗體與SGC7901細胞結(jié)合，以FITC標記的EGFR分子標記檢測與人PBLS細胞的結(jié)合，并在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)10個高倍視野計算平均陽性細胞率即為平均結(jié)合率。

1.2.3 EGFR/CD3 BsAb 介導(dǎo) PBLS 細胞對 SGC7901細胞殺傷率檢測:采用MTT比色法［4］，將靶細胞接種于96孔板中，每孔約1×104個細胞，培養(yǎng)24 h后，設(shè)置單靶細胞和單效應(yīng)細胞對照組，其余按下述實驗分組加入不同組分，每組設(shè)置5個重復(fù)對照，其中PBLS細胞按效靶比80∶1加入。A組:EGFR/CD3 BsAb(20 μg/mL)+PBLS細胞(2×105/mL)+SGC7901(2×105/mL);B 組:CD3 McAb(20 μg/mL)+PBLS細胞(2×105/mL)+SGC7901(2×105/mL);C組:EGFR McAb(20 μg/mL)+PBLS細胞(2 ×105/mL)+SGC7901(2× 105/mL);D 組:CD3 McAb(10 μg/mL)+EGFR McAb(10 μg/mL)+SGC7901 細胞(2 ×105/mL)+PBLS細胞(2×105/mL);E組:PBLS細胞(2×105/mL)+SGC7901(2×105/mL)，細胞培養(yǎng)24 h后，每孔各加入30 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h，吸去上清后每孔加入DMSO 100 μL并振搖30 min，用酶標儀測定，檢測波長為590 nm。按公式計算出殺傷率。

1.2.4 EGFR/CD3 BsAb介導(dǎo)PBLS細胞在不同效靶比下殺傷率檢測:MTT法檢測，實驗方法與上一步相同，只檢測EGFR/CD3 BsAb介導(dǎo)PBLS細胞，按PBLS細胞與靶細胞的不同效靶比分為:40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1 共 8 組，每組設(shè)置 5 個重復(fù)對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，利用雙因素及單一因素方差分析等方法進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白電泳結(jié)果 顯示制備的EGFR/CD3 BsAb分子量大小約為兩單克隆抗體分子量之和，無其他雜帶出現(xiàn)，表明分離較純(見圖1)。

圖1 蛋白電泳結(jié)果顯示制備的EGFR/CD3 BsAb分子量大小約為43 KDFig 1 The result of SDS-PAGE showed that the relative molecular mass of EGFR/CD3 BsAb was about 43 KD

2.2 間接細胞免疫熒光法測定 雙功能抗體與SGC7901及 PBLS細胞的結(jié)合率分別為82.6%和74.4%，表明雙功能抗體與瘤細胞效應(yīng)細胞的結(jié)合能力較強(見圖2)。

圖2 間接細胞免疫熒光法測定雙功能抗體與SGC7901及PBLS細胞的結(jié)合率結(jié)果 A:雙功能抗體與SGC7901細胞結(jié)合;B:雙功能抗體與PBLS細胞結(jié)合;C:空白對照組檢測結(jié)果Fig 2 The results of the cellular immumofluorescence detection A:The results of EGFR/CD3 BsAb’s binding to SGC7901 cells;B:The results of EGFR/CD3 BsAb’s binding to PBLS cells;C:The results of blank control group

2.3 細胞殺傷率比較 A組EGFR/CD3 BsAb介導(dǎo)PBLS細胞對胃癌細胞株SGC7901殺傷率為52.4% ±5.8%，顯著高于其余各對照組(P＜0.05)，C組和 D組又略高于其他兩組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余組之間無顯著差異，具體結(jié)果見圖3。

2.4 EGFR/CD3 BsAb介導(dǎo)PBLS細胞在不同效靶比下的殺傷率 EGFR/CD3 BsAb介導(dǎo)PBLS細胞在不同效靶比下殺傷率有明顯不同，在低于70∶1～80∶1時隨著效靶比增加殺傷率顯著提高，但在80∶1后曲線平緩，表明殺傷作用提升不明顯，具體結(jié)果見圖4。

圖3 各組抗體介導(dǎo)效應(yīng)細胞對SGC7901細胞的殺傷率Fig 3 The cell lysis rates of PBLS cells retargeted by BsAb against SGC7901 cells in all groups

圖4 EGFR/CD3 BsAb介導(dǎo)PBLS細胞在不同效靶比下殺傷率Fig 4 The cell lysis rates of PBLS cells mediated by EGFR/CD3 BsAb against SGC7901 cells on different E∶T

3 討論

目前針對各類惡性腫瘤的分子靶向治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，成為繼傳統(tǒng)化療、放療之后內(nèi)科治療腫瘤的又一有力武器。對于以胃癌為代表的胃腸道腫瘤主要的分子靶向藥物是以表皮生長因子受體(EGFR)為靶標的單抗和化學(xué)小分子抑制物。EGFR是C-erbB-1基因的表達產(chǎn)物，廣泛分布于各組織［5-6］。EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤細胞的增殖、損傷修復(fù)、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用。研究表明［7］在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達。近年來靶向EGFR藥物已成為腫瘤治療的新熱點。在已投入臨床實際應(yīng)用中的靶向藥物中以EGFR為靶點的單克隆抗體或化學(xué)抑制劑最為成熟。其中以ABX-EGF、IMC-C225(cetuximab)［8］、MAB528、MAB225［9］為代表的單抗類藥物和以吉非替尼、erlotinib等為代表的小分子酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)為腫瘤的治療提供了新的希望。Cetuximab在結(jié)腸癌的治療中已經(jīng)成為重要的二線藥物，在胃癌的治療中也顯示了良好的療效。

但是單純的單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑可能缺少免疫細胞配合難以充分發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，治療作用有限。本項研究旨在通過相對簡單的方法合成EGFR/CD3雙功能抗體，這樣理論上既可起到原單抗的抗瘤作用同時可介導(dǎo)體內(nèi)免疫效應(yīng)細胞對EGFR表達陽性的胃癌細胞結(jié)合及殺傷。本項研究結(jié)果提示EGFR/CD3 BsAb在體外條件下介導(dǎo)免疫效應(yīng)細胞對胃癌細胞的殺傷作用顯著強于單克隆抗體。這一結(jié)果說明至少在體外條件下EGFR/CD3 BsAb確實起到了橋接效應(yīng)細胞與腫瘤細胞的作用，為效應(yīng)細胞的殺傷提供了有力的幫助。目前國內(nèi)有少數(shù)研究者［10］采取類似方法合成了部分雙功能抗體，并取得了一定的實驗成果。國外類似研究開展的也較少，其中部分［11-12］以CD3單抗為基礎(chǔ)合成雙功能抗體并引導(dǎo)免疫效應(yīng)細胞攻擊乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細胞的研究結(jié)果提示此類雙功能抗體能夠強有力地提高抗瘤效果，但是對于胃癌的類似研究國外未見報道。結(jié)合這些研究結(jié)果，我們的實驗結(jié)果提示EGFR/CD3 BsAb雙功能抗體治療胃癌可能具有重要的臨床應(yīng)用前景。

但是本項研究中存在著雙功能抗體制備技術(shù)落后的問題，目前化學(xué)偶聯(lián)合成只是最初的方法，用這種方法合成的雙功能抗體分子量大，抗原性可能較強這些均影響了其潛在的臨床使用。下一步我們將嘗試雙雜交瘤技術(shù)和基因工程技術(shù)制備分子量更小、更高效的雙功能抗體以便更接近于臨床應(yīng)用。在實驗中由于時間和經(jīng)費的原因只進行了體外細胞學(xué)實驗。在下一步研究中我們將進行體內(nèi)動物模型實驗，進一步在胃癌的模型動物上驗證該雙功能抗體的抗腫瘤功效。我們相信隨著單克隆抗體類分子靶向藥物的廣泛應(yīng)用，其不足之處也會逐漸體現(xiàn)，作為單抗藥物的發(fā)展與補充，雙功能抗體將最終廣泛應(yīng)用于臨床，為進展期腫瘤患者提供新的治療選擇。

［1］ Lefterova P，M?rten A，Buttgereit P，et al.Targeting of natural killerlike T immunologic effector cells against leukemia and lymphoma cells by reverse antibody-dependent cellular cytotoxicity［J］.J Immunother，2000，23(3):304-310.

［2］ Tita-Nwa F，Moldenhauer G，Herbst M，et al.Cytokine-induced killer cells targeted by the novel bispecific antibody CD19xCD5(HD37xT5.16)efficiently lyse B-lymphoma cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2007，56(12):1911-1920.

［3］ Chen Y，Yang SC，Luo H.A chermira antibody erythroimmunoassay for detecting HBsAg in human sera［J］.Res Virol，1990，141(3):337-339.

［4］ Qu Q，Peng HX，Zong L，et al.The preparation of anti-CD3/anti cyclinD1，bispecific monoclonal antibodise and killing effect on the endometrial carcinoma cells［J］.J Fourth Mil Med Univ，2004，25(18):1663-1665.

曲群，彭慧霞，宗璐，等.雙功能抗體抗CD3/抗CyclinD1的制備及對子宮內(nèi)膜癌細胞的殺傷作用［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，25(18):1663-1665.

［5］ Alan W.Molecules in focus EGF receptor［J］.Int J Biochem Cell Biol，1999，31(6):637-643.

［6］ Reiter JL，Maihle NJ.A 1.8kb aleration transcript form the human epidermal groth factor gene encodes a truncated form of the receptor［J］.Nucleic Acids Res，1996，24(20):4050-4056.

［7］ Baselga J.Why the epidermal growth factor receptor?The rational for cancer therapy［J］.Oncologist，2002，7(4):2-8.

［8］ Herbst RS，Langer CJ.Epidermal growth factor receptors as a target for cancer treatment:the emerging role of IMC-C225 in the treatment of lung and head and neck cancer［J］.Semin Oncol，2002，29(1):27-36.

［9］ Rusch V，Mendslsohn J，Dmitrovsky E.The epidermal growth factor receptor and its ligind as therapeutic targets in human tumors［J］.Cytokine Growth Factor Rev，1996，7(2):133-141.

［10］ Gao XS，Wan WH，Zhang H.Preparation of Anti CD_3/Anti TNP(BsAb)and Mediation of Cytotoxicity of MGC803［J］.Cancer Research on Prevention and Treatment，2000，27(2):84-85.

高學(xué)碩，萬文微，張宏.抗CD3/抗TNP雙功能抗體的制備及對胃癌細胞系的殺傷作用［J］.腫瘤防治研究，2000，27(2):84-85.

［11］ Kornacker M，Verneris M，Kornacker B，et al.The apoptotic and proliferative fate of cytokine-induced killer cells after redirection to tumor cells with bispecific Ab ［J］.Cytotherapy，2006，8(1):13-23.

［12］ Flieger D，Kufer P，Beier I，et al.A bispecific single-chain antibody directed against EpCAM/CD3 in combination with the cytokines interferon alpha and interleukin-2 efficiently retargets T and CD3+CD56+natural-killer-like T lymphocytes to EpCAM-expressing tumor cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2000，49(8):441-448.