魚腥草素鈉對BALB/c小鼠的急性毒性及其對細胞的損傷

樓希文，欒 洋，姜寶紅，陳笑艷，鐘大放

(中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物代謝研究室，上海 201203)

魚腥草注射液為鮮魚腥草經(jīng)過雙蒸餾得到的揮發(fā)油精制而成的滅菌水溶液，其主要成分為魚腥草素(化學(xué)結(jié)構(gòu)為癸酰乙醛)、甲基正壬酮、月桂醛等［1］。由于揮發(fā)油成分不穩(wěn)定、易聚合，于是通過人工合成制得了魚腥草素的亞硫酸氫鈉加成物即魚腥草素鈉(sodium houttuyfonate，SH)，作為單體藥物使用。而SH的同系物，十二酰乙醛亞硫酸氫鈉加成物，同魚腥草素、SH有相似的藥理作用，因而在臨床上被制成新魚腥草素鈉注射液來發(fā)揮作用［2］。這類注射液具有抗菌、抗炎、增強機體免疫的作用，常用于治療呼吸道感染、支氣管炎和急性盆腔炎等疾?。?］。由于價格低廉，魚腥草類注射液曾在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。但是，1988-2006年，國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心共收到魚腥草注射液的不良反應(yīng)報告5000多例，嚴重不良反應(yīng)者222例，死亡35例。這些不良反應(yīng)包括呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚損害、神經(jīng)系統(tǒng)損害及過敏性休克等癥狀［4］。2006年，國家食品藥品監(jiān)督管理局下發(fā)緊急通知，在全國范圍內(nèi)暫停使用魚腥草注射液等7個注射劑，暫停受理和審批魚腥草注射液等7個注射劑的各類注冊申請，并將組織對該類藥品進行安全性再評價。

近年來，對魚腥草類注射液產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng)的原因，進行了一系列研究。主要的觀點認為，魚腥草類注射液所致的臨床不良反應(yīng)中，約3/4屬于類過敏反應(yīng)，并且，注射液配制過程中使用的助溶劑吐溫-80是其產(chǎn)生過敏反應(yīng)的主要誘因［1-5］。通過觀察SH的結(jié)構(gòu)式，發(fā)現(xiàn)它和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)都具有親水和疏水的基團(圖1)。研究表明，SH能夠以表面活性劑的方式來影響細胞膜的通透性［6-8］。此外，研究表明，藥物不良反應(yīng)的產(chǎn)生很大程度上是由于藥物與體內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的共價結(jié)合引起的［9-10］。本實驗室前期研究表明，SH在體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化為魚腥草素［11］;在體內(nèi)和體外與蛋白發(fā)生加合反應(yīng)，并且鑒定了形成加合物的類型及確定了結(jié)合的位點［12-13］。目前，關(guān)于SH自身對于小鼠急性毒性的報道很少，因此，本實驗采用近交系小鼠BALB/c小鼠，單次、ip給予SH，觀察SH的急性毒性，并對毒性產(chǎn)生的原因進行初步探討。

Fig.1 Chemical structure of sodium houttuyfonate(A)and sodium dodecyl sulfate(B).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

SH，批號:HS110203001，純度99.8%，購自湖北恒碩化工有限公司。吐溫-80、無水乙醇、二甲苯、SDS和甲醛購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。TP1020型樣品預(yù)處理機、EG1150H型包埋機、RM2016型切片機、HI1210型展片機、HI1220型烘片機購自Leica公司，BX51型顯微鏡購自O(shè)lympus公司。Multiskan Ascent型酶標儀購自Thermo Electron公司。乳酸脫氫酶體外毒性檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。組胺ELISA試劑盒購自美國Immuno-Biological Laboratories公司。

1.2 動物

BALB/c近交系小鼠，雄性，由上海實驗動物資源中心(西普爾-必凱公司)提供許可證號2011-10-ZDF-07，6～8周周齡，體質(zhì)量(20±2)()g。飼養(yǎng)在上海藥物所SPF級動物房，環(huán)境符合相關(guān)規(guī)定。動物自由飲水及進食。

1.3 動物分組給藥及急性毒性觀察

小鼠按體質(zhì)量隨機分為4組，溶媒對照組和SH 50，125和200 mg·kg-1組，每組10只;溶媒對照組(5只)，ip給予含有1%吐溫-80的生理鹽水。進行單次ip給藥，給藥容積為40 ml·kg-1。給藥后觀察小鼠外觀體征和行為活動，共觀察4d，記錄小鼠的死亡情況。對死亡的小鼠進行解剖，肉眼檢查主要臟器有無異常變化。

1.4 病理組織學(xué)檢查

另取6只小鼠，分為3組，每組2只，分別為溶媒對照組、SH 125和200 mg·kg-1組。采用單次ip給藥。在給藥后2 h處死溶媒對照組和 SH 125 mg·kg-1組小鼠，SH 200 mg·kg-1組小鼠則等待其自然死亡。采集之前解剖時觀察到的有異常的組織，用10%甲醛-生理鹽水溶液固定。3 d之后進行脫水、浸蠟、包埋、切片、展片。隔夜晾干，烘片，進行HE染色及顯微鏡觀察。

1.5 血漿中組胺的測定

取6只BALB/c小鼠，分成2組，每組3只。溶媒對照組ip給予含有1%吐溫-80的生理鹽水，給藥組ip給予SH 125 mg·kg-1，30 min 之后眼眶取血，720 ×g 離心3 min，去除血細胞，取上清用于組胺測定。

1.6 THP-1細胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的測定

人急性單核白血病細胞系(THP-1)細胞，720×g離心4 min，去除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，得細胞后進行計數(shù)，加入SH，使終濃度依次為0.01，0.1，1，10和100 mg·L-1，室溫孵育60 min，測細胞上清液LDH含量，用480 nm的吸光度值(A480nm)歸零處理后得到的相對值表示。

1.7 腹腔細胞的制備及乳酸脫氫酶和組胺的測定

1.7.1 腹腔細胞制備

乙醚麻醉未給藥BALB/c小鼠，并用75%乙醇消毒。ip給予3 ml的無菌PBS溶液，然后輕柔地按摩腹部90 s。之后打開腹腔，用巴氏吸管吸出灌洗液，將小鼠斷頸處死。將得到的腹腔灌洗液于720×g離心4 min，棄上清，得到腹腔細胞。加入3 ml的PBS，720×g離心4 min，共3次。最后將得到的細胞進行計數(shù)。

1.7.2 乳酸脫氫酶的測定

取小鼠的腹腔細胞，加入終濃度為SH 32和128 mg·L-1，溶媒對照組加入 DMSO，室溫孵育60 min。720×g離心4 min，取上清，依次加入96孔板，每孔45 μl。將等體積的LDH底物溶液、LDH染料溶液及LDH輔酶溶液混合，按照2∶1的比例和腹腔細胞上清液混合，即每孔加入90 μl。避光，室溫孵育20～30 min。加入1/10體積的HCl 1 mol·L-1終止反應(yīng)。利用酶標儀測定A490nmLDH用經(jīng)歸零后的相對值表示。

1.7.3 組胺的測定

取小鼠的腹腔細胞，加入SH，使終濃度分別為32和128 mg·L-1，溶媒對照組加入 DMSO，室溫孵育60 min。720×g離心4 min，取上清，作為樣品。

首先進行樣品的酰化反應(yīng)。向反應(yīng)平板中分別依次加入25 μl標準品、質(zhì)控樣品或待測樣品，然后加入25 μl?；彌_液和25 μl?；噭?，室溫振蕩45 min;再加入200 μl蒸餾水，室溫振蕩15 min;取25 μl?；玫臉悠芳拥筋A(yù)包被的8聯(lián)管中，進行組胺ELISA分析。每孔加入100 μl組胺抗血清，混勻，封口膜密封，4℃放置15～20 h。棄去每孔的反應(yīng)液，用洗滌緩沖液洗4次，放在吸水紙上拍干。每孔加入100 μl酶結(jié)合物，室溫振蕩孵育30 min。按上述方法洗滌每孔加入100 μl底物，避光，室溫振蕩孵育20～30 min，加入100 μl終止緩沖液，搖勻，然后用酶標儀讀取450 nm處的吸光值。利用標準品作出標準曲線，并依此算出樣品的濃度。

1.8 溶血觀察

4只BALB/c小鼠，分成2組，每組2只。溶媒對照組ip給予含有1%吐溫-80的生理鹽水，給藥組ip給予SH 125 mg·kg-1，2 h之后眼眶取血，720×g離心3 min，去除血細胞，觀察上清溶血的情況。

取健康志愿者血液3 ml，肝素鈉抗凝，置于離心管中。加入約20 ml生理鹽水，180×g離心5 min，2～3次，洗至上清呈無色透明，棄去上清，用生理鹽水稀釋成2%(V/V)的血細胞懸液。將不同濃度的SH和等份的血細胞懸液一起放在試管中，置于37℃恒溫水浴鍋中孵育，并且設(shè)置陰性對照(生理鹽水)組，陽性對照(蒸餾水)和溶劑對照組。開始每15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，連續(xù)觀察3 h。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 魚腥草素鈉對BALB/c小鼠的急性毒性及對肝細胞形態(tài)的影響

單次ip給予SH后，SH 50 mg·kg-1組小鼠表現(xiàn)正常，與正常對照組沒有差異;SH 125和200 mg·kg-1組的小鼠表現(xiàn)出閉眼、弓背、豎毛及自主活動減少等狀態(tài)。給藥后觀察4 d，死亡大多發(fā)生在24 h之內(nèi)，未死亡的小鼠2～3 d后狀態(tài)慢慢恢復(fù)。小鼠單次ip給予SH 125和200 mg·kg-1后分別有6只和10只(全部)死亡。SH 50 mg·kg-1組無動物死亡現(xiàn)象。對死亡的小鼠進行尸體解剖，發(fā)現(xiàn)肝充血腫大。病理組織學(xué)檢查(圖2)發(fā)現(xiàn)，SH 125和200 mg·kg-1組小鼠的肝小葉中央靜脈和肝竇有紅細胞聚集的現(xiàn)象(圖2B和圖2C)。

2.2 魚腥草素鈉對血漿中組胺含量的影響

ip給予SH 125 mg·kg-130 min后小鼠血漿中組胺含量為(66.1 ±3.9)mg·L-1明顯地高于溶媒對照組的(45.8 ±9.6)mg·L-1(n=3，P ＜0.05)。

2.3 魚腥草鈉對THP-1細胞中乳酸脫氫酶活性的影響

SH 0，0.01，0.1，1，10 和100 mg·L-1與 THP-1細胞一起孵育60 min后，LDH的相對含量分別為1.7 ±2.1，4.±2.6，8.7 ±5.8，17.0 ±8.5，69.3 ±5.7 和139.3 ± 11.0，SH 10和100 mg·L-1LDH 組顯著升高(n=3，P ＜0.01)。說明 SH 10和100 mg·L-1能夠引起顯著的細胞損傷。

Fig.2 Effect of SH on liver section of BALB/c mice(HE ×40).BALB/c mice were peritoneally injected with SH 125 and 200 mg·kg-1，respectively.，the mice in SH 125 mg·kg-1group were executed to death 2 h after injection.mice in SH 200 mg·kg-1group，waited until the mice died.The livers were fixed and applied to paraffin section and HE staining.A:solvent control group;B and C:SH 125 and 200 mg·kg-1groups，respectively.

2.4 魚腥草鈉對腹腔細胞組胺含量及LDH活性的影響

表1結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，SH 32和128 mg·L-1組細胞上清液中組胺含量和LDH活性明顯增高(P＜0.05)，說明SH能夠引起細胞損傷。

Tab.1 Effect of SH on LDH and histamine in peritonal cells

2.5 SH對溶血作用的影響

BALB/c小鼠ip 給予SH 125 mg·kg-1，2 h 之后采血，與溶劑對照組比較，發(fā)現(xiàn)SH組發(fā)生了明顯的溶血現(xiàn)象(圖3A)。采用人血細胞進行體外溶血實驗，生理鹽水陰性對照組和DMSO對照組不會引起溶血，蒸餾水陽性對照組會引起溶血;而 SH 25～125 mg·L-1能夠引起明顯的溶血現(xiàn)象(圖3B)。

Fig.3 Effect of SH on hemolysis of BALB/c mice blood(A)and human blood(B).A.1-2:solvent control;3-4:SH 125 mg·kg-1group.B.1:negative control group;2:solvent control group;3:positive control group(distilled water);4-8:SH 25，50，75，100，125 mg·L-1group，respectively.

3 討論

通過BALB/c小鼠單次ip給予不同劑量的SH之后的死亡情況和致死劑量與文獻報道致死劑量相當，SH具有一定的急性毒性。實驗中觀察到小鼠在給藥之后，最快5 h左右就能死亡，而充血的肝提示循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生衰竭的可能。通過與結(jié)構(gòu)類似物SDS的致死情況比較，推測SH的毒性機制可能與其類似，以其表面活性劑的方式破壞了細胞膜，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)含物的釋放。而腹腔細胞中有相當一部分為肥大細胞，它們的內(nèi)容物組胺就會引起全身速發(fā)型過敏反應(yīng)［14-15］。本研究體內(nèi)和體外實驗都證明了這一點。在此之前，相當一部分研究關(guān)注的重點都是魚腥草注射液配制過程中的增溶劑吐溫-80的毒性，而本研究表明，SH也在其不良反應(yīng)的發(fā)生過程中發(fā)揮了一定的作用，即魚腥草類注射液的活性成分之一魚腥草素鈉能夠在體外實驗中刺激小鼠腹腔細胞釋放LDH和組胺;并在體內(nèi)引起小鼠血漿中組胺含量升高，組胺的釋放引起血壓降低及毛細血管通透性增大，當血壓降低到一定程度時，循環(huán)系統(tǒng)就衰竭，進而導(dǎo)致死亡。本實驗結(jié)果顯示，當SH大于25 mg·L-1以上時，對于人紅細胞具有顯著的溶血作用，李學(xué)剛等［10］也曾經(jīng)證明了SH對于兔紅細胞的溶血作用。因此，以SH單體為主要成分的藥物在臨床上不能以注射劑形式來使用。

比較小鼠ip給予SH和SDS之后的情況，發(fā)現(xiàn)SH的致毒劑量更小(未發(fā)表結(jié)果)。從結(jié)構(gòu)上說，與SDS相比，SH還具有羥基和β位羰基，并且，它在體內(nèi)還能一部分轉(zhuǎn)化成為具有β-酮醛基團的魚腥草素。因此，推測，除了通過以表面活性劑的特性來破壞細胞之外，SH還存在著其他的毒性機制。在之前的研究中，本實驗室證明了SH能夠和蛋白發(fā)生共價結(jié)合，并測定了結(jié)合位點及結(jié)合量［12-13］;這提示SH可能會破壞體內(nèi)大分子，進而引起全身免疫反應(yīng)［16-17］。另外，鑒于由魚腥草注射液引起的急性過敏性休克的發(fā)生率很低，推測此類不良反應(yīng)的發(fā)生應(yīng)該取決于多重因素，而這些都需要進一步研究來證實。

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