腫瘤干細(xì)胞理論及腫瘤干細(xì)胞分離和鑒定研究進(jìn)展

宋東穎，王 毅，孫 嵐，張英鴿

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所納米藥理毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021)

腫瘤干細(xì)胞是指腫瘤中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生出異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，這類細(xì)胞與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有密切聯(lián)系［1-2］。這類細(xì)胞的很多性質(zhì)與干細(xì)胞類似，因此將其稱為腫瘤干細(xì)胞。

目前，臨床腫瘤治療中的主要難題就是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)腫瘤學(xué)理論認(rèn)為，所有的腫瘤細(xì)胞都具有無限增殖的能力，因此，臨床上主要是通過手術(shù)、放療和化療對整個實(shí)體腫瘤病灶進(jìn)行殺傷，然而這些治療方法不能有效地殺死癌癥病灶，特別是對轉(zhuǎn)移病灶治療效果更是有限。并且很多患者在結(jié)束治療后會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)現(xiàn)象，復(fù)發(fā)后的腫瘤對于化療或放療具有極強(qiáng)的耐受性，傳統(tǒng)腫瘤學(xué)理論無法合理解釋腫瘤的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)現(xiàn)象。隨著實(shí)體腫瘤研究的深入展開，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞理論隨之誕生。

1 腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

早在20世紀(jì)50年代，Hewitt等［3］在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的自體/異體移植實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，將白血病小鼠的腫瘤細(xì)胞移植到同種小鼠體內(nèi)后，僅有0.1% ～1%的少部分細(xì)胞形成克隆集落。對此研究人員提出兩種不同的理論來解釋這一發(fā)現(xiàn):一種理論認(rèn)為出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于腫瘤細(xì)胞具有同質(zhì)性，即每一個腫瘤細(xì)胞都具有新生腫瘤的潛力，但是能進(jìn)入細(xì)胞分化周期的腫瘤細(xì)胞很少，是一個小概率隨機(jī)事件，這就是腫瘤的隨機(jī)化理論;另一種理論就是分層理論，即腫瘤細(xì)胞具有功能異質(zhì)性，只有有限數(shù)目的腫瘤細(xì)胞具有產(chǎn)生腫瘤的能力，并且這些腫瘤細(xì)胞再生腫瘤是高頻事件，而這一理論逐漸被更多的研究人員所接受。這類具有非常高的增殖能力、分化能力和致瘤能力的細(xì)胞也成為了研究的重點(diǎn)。

1977年，Hamburger等［4-5］在骨髓瘤等細(xì)胞的體外軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有不到0.2%的骨髓瘤細(xì)胞才能形成克隆，不到4%的細(xì)胞才能在非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(nonobesediabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠脾內(nèi)形成腫瘤，并提出了通過殺傷此類細(xì)胞而達(dá)到治愈腫瘤的設(shè)想。此后，多個研究組在肺小細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等腫瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。有人將這些小量的具有成瘤能力的細(xì)胞稱之為“腫瘤干細(xì)胞”，也提出通過殺傷腫瘤干細(xì)胞有可能達(dá)到治愈腫瘤的目的，“腫瘤干細(xì)胞假說”逐漸受到了研究人員們的關(guān)注。1997年，Bonnet等［6］研究人類急性粒細(xì)胞白血病時，首次成功分離出了表型為CD34+和CD38-的白血病腫瘤干細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞相比具有很高的體內(nèi)成瘤能力，從而證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在。隨后在其他多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中也證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在［7-8］。

2 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，發(fā)生腫瘤的根源就是機(jī)體組織中形成了腫瘤干細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞的來源有三個途徑:①正常組織中原有的干細(xì)胞由于突變因素的積累，發(fā)生突變而產(chǎn)生;②組織中含有的祖細(xì)胞發(fā)生基因重排，從新獲得與干細(xì)胞類似的表型和特性，形成腫瘤干細(xì)胞;③骨髓來源的干細(xì)胞發(fā)生突變產(chǎn)生［9］。而這些突變一般發(fā)生于某些信號通路中的關(guān)鍵蛋白，這些信號通路在干細(xì)胞增殖和更新過程中發(fā)揮重要作用，例如Wnt通路、Notch通路等。

2.1 Wnt通路

Wnt信號通路是一類廣泛作用于動物生長發(fā)育過程的信號通路，對細(xì)胞增殖、分化、遷移過程以及干細(xì)胞池的維持和不對稱分裂等方面起著重要的作用，并且可以決定細(xì)胞的極性、命運(yùn)，在成年期則主要參與機(jī)體內(nèi)平衡的穩(wěn)定。

該通路中有兩個關(guān)鍵蛋白:Wnt蛋白和β聯(lián)蛋白。Wnt蛋白是細(xì)胞內(nèi)一類分泌型糖蛋白，是此通路的起始蛋白，它能與胞膜上的卷曲蛋白受體家族和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)中的LRP-5和LRP-6結(jié)合。β聯(lián)蛋白是該通路發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。正常狀態(tài)下，由酪蛋白激酶1α、糖原合成酶激酶-3β、抑癌因子APC和軸蛋白(axin)組成的β聯(lián)蛋白降解復(fù)合體可與β聯(lián)蛋白結(jié)合，使胞內(nèi)β聯(lián)蛋白含量維持在一個較低水平。

在正常細(xì)胞中WNT抑制因子-1(Wnt inhibitory factor-1，WIF-1)，Cerberus和分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白家族(如FrzB)競爭性地抑制Wnt蛋白與卷曲蛋白受體結(jié)合，而Dickokpf家族(如DKK-1和DKK-2)通過間接減少可利用的輔助受體LRP的數(shù)量來抑制Wnt蛋白與LRP-5，LRP-6等受體結(jié)合。如果此抑制過程中的某些蛋白發(fā)生突變，Wnt蛋白可與相應(yīng)受體發(fā)生結(jié)合，從而活化Wnt信號使細(xì)胞內(nèi)散亂蛋白激活?；罨纳y蛋白能使β聯(lián)蛋白降解復(fù)合體發(fā)生解離，β聯(lián)蛋白從而可以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生積聚，最后進(jìn)入細(xì)胞核啟動靶基因過度轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其靶基因包括原癌基因c-myc、周期蛋白D1、基質(zhì)溶解酶、成纖維細(xì)胞生長因子、上皮細(xì)胞生長因子和存活蛋白等，而這些表達(dá)產(chǎn)物均有助于腫瘤的發(fā)生和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，大部分胃腸道癌癥均是由Wnt通路突變引起的，其中β聯(lián)蛋白降解復(fù)合體中的APC是最常見的突變位點(diǎn)，該通路的突變最終引起β聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的靶基因過度表達(dá)而引起腫瘤的發(fā)生［10］。進(jìn)一步研究表明，在白血病和乳腺癌等多種腫瘤干細(xì)胞發(fā)生早期均伴有Wnt通路的突變或調(diào)節(jié)異常，而且Wnt信號通路在腫瘤干細(xì)胞的穩(wěn)定和自我更新過程中發(fā)揮著重要作用［11-13］。

2.2 Notch 通路

Notch通路在脊椎動物和無脊椎動物的發(fā)育過程中，對細(xì)胞生長、發(fā)育和凋亡、命運(yùn)的決定、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、器官的形成等生理過程具有重大意義，并且證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中也起著重要作用。

Notch受體是細(xì)胞中廣泛存在的一類高度保守的受體蛋白。該受體在細(xì)胞中首先以單體蛋白的形式合成，經(jīng)高爾基體的修飾后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，最后經(jīng)過原蛋白轉(zhuǎn)化酶切割與Lin-12/Notch重復(fù)蛋白(Lin-12/Notch repeats，LNR)在跨膜區(qū)形成異二聚體，形成成熟的Notch受體。當(dāng)成熟的Notch受體與相鄰細(xì)胞的Notch配體發(fā)生作用后，受體通過先后兩次裂解，釋放出活化的Notch受體胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。通過細(xì)胞內(nèi)吞作用和膜泡運(yùn)輸，NICD經(jīng)過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，首先與DNA轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL結(jié)合形成短期的核轉(zhuǎn)錄異二聚體復(fù)合物，接著與轉(zhuǎn)錄輔助激活蛋白MAML結(jié)合形成三聚體，MAML能募集組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶等乙酰化組蛋白的因子，最終三聚體成為轉(zhuǎn)錄激活因子誘導(dǎo)其下游靶基因的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路由于所處環(huán)境的不同，在不同癌細(xì)胞中起著不同的作用，即該通路發(fā)揮作用具有環(huán)境依賴性。該通路根據(jù)被激活Notch受體種類、被激活受體量的不同、細(xì)胞種類的不同、細(xì)胞所處微環(huán)境的不同、通路與其他通路所處關(guān)系的不同，既有可能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，也可能抑制癌細(xì)胞的作用［14］。

3 腫瘤干細(xì)胞的特性

腫瘤干細(xì)胞顧名思義既具有腫瘤細(xì)胞的特性，同時也具有正常干細(xì)胞的某些特性，具體有如下基本特性。

(1)腫瘤干細(xì)胞不是處于分化途徑的終端，而是保持未分化的狀態(tài)，具有無限增殖能力和分化潛能。腫瘤的發(fā)生是一個長期的突變積累過程，在皮膚及腸黏膜上皮等腫瘤的高發(fā)部位，衰老細(xì)胞不斷地死去并脫離機(jī)體，只有干細(xì)胞是唯一可以長期存在的細(xì)胞，有可能積累多次突變而生成腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而最終形成腫瘤［15］。

(2)腫瘤干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞當(dāng)中所占的比例非常小，它主要通過兩種方式分裂:一種是對稱分裂，即形成兩個相同的腫瘤干細(xì)胞或兩個相同的分化腫瘤細(xì)胞;另一種是非對稱分裂，即腫瘤干細(xì)胞分裂后形成的兩個細(xì)胞中有一個細(xì)胞不可逆地走向分化的終端成為功能專一的分化腫瘤細(xì)胞，而另一個保持親代的特征，仍作為腫瘤干細(xì)胞保留下來［16］。由于這種類似于干細(xì)胞的分裂方式，低密度的腫瘤干細(xì)胞能在維持自身數(shù)量的同時產(chǎn)生出分化的腫瘤細(xì)胞。

(3)腫瘤干細(xì)胞具有高端粒酶活性以及擴(kuò)增的端粒重復(fù)序列，高活性的端粒酶可抑制細(xì)胞增殖過程中端粒長度的縮短，延長腫瘤干細(xì)胞的增殖壽命，這為腫瘤干細(xì)胞的不斷增殖和分化提供了基礎(chǔ)條件［15］。

(4)腫瘤干細(xì)胞內(nèi)抗凋亡家族蛋白過表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤干細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)量顯著增加，從而啟動腫瘤干細(xì)胞內(nèi)抗凋亡程序，阻斷Bid和Bad等促凋亡蛋白引起的線粒體凋亡途徑，并進(jìn)一步阻斷胱天蛋白酶凋亡途徑，防止腫瘤干細(xì)胞發(fā)生凋亡［17］。

(5)腫瘤干細(xì)胞的DNA修復(fù)能力顯著增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞內(nèi)與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等酶蛋白的合成增加、活性增強(qiáng)，增強(qiáng)了腫瘤干細(xì)胞的抗DNA損傷能力，使得腫瘤干細(xì)胞可逃避以DNA損傷為主的腫瘤治療手段［18］。

(6)腫瘤干細(xì)胞除在連續(xù)分裂的一段時間外，其余較長時間均是處在G0期，即相對靜止?fàn)顟B(tài)。而現(xiàn)在臨床上普遍使用的化療藥物主要是針對增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，處在G0期的大多數(shù)腫瘤干細(xì)胞能逃避傳統(tǒng)腫瘤治療方法的殺傷，一旦時機(jī)成熟或停止用藥，它們便成為復(fù)發(fā)的根源［19］。

(7)腫瘤干細(xì)胞通常位于由發(fā)育良好的三維細(xì)胞外基質(zhì)包裹的低氧環(huán)境中，這些細(xì)胞外基質(zhì)起到很好的屏障作用，盡可能避免了腫瘤干細(xì)胞接觸到抗腫瘤藥物。同時由于射線引起的DNA損傷需要氧氣，所以腫瘤干細(xì)胞所處的低氧環(huán)境使得放療對腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用也非常局限［20-21］。

(8)腫瘤干細(xì)胞能夠表達(dá)與某些干細(xì)胞相同的特殊功能蛋白或特異性表面標(biāo)志，如CD133，CD90和CD44等。這些特異性蛋白或標(biāo)志物在腫瘤干細(xì)胞的增殖、腫瘤干細(xì)胞分化成腫瘤組織周圍所必須的血管等組織、腫瘤干細(xì)胞的遷移等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。利用這些特異性的表面標(biāo)志物達(dá)到腫瘤干細(xì)胞分離或鑒定的目的。

(9)腫瘤干細(xì)胞在形成和發(fā)展過程中，生物學(xué)特征和功能均會有適當(dāng)?shù)母淖?。如正常干?xì)胞由于周圍微環(huán)境的改變或其他突變因素的刺激形成癌前期干細(xì)胞，癌前期干細(xì)胞能表達(dá)OCT3/4，SOX2和KLF4等，能促進(jìn)干細(xì)胞自我更新能力和多向分化能力［22］。突變進(jìn)一步積累癌前期干細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樵┠[瘤干細(xì)胞，不斷分化形成腫瘤細(xì)胞和腫瘤周圍血管從而最終形成腫瘤。另有研究表明，并非所有原癌腫瘤干細(xì)胞都能轉(zhuǎn)移，Hermann等［23］在研究胰腺癌的時候發(fā)現(xiàn)，CD133+/CXCR4+和CD133+/CXCR4-都具有異種動物連續(xù)成瘤能力，即均為胰腺癌腫瘤干細(xì)胞，具有無限自我更新能力和分化潛能。但是只有CD133+/CXCR4+的腫瘤干細(xì)胞才能引起胰腺癌的轉(zhuǎn)移，而CD133+/CXCR4-的腫瘤干細(xì)胞則不會導(dǎo)致胰腺癌的轉(zhuǎn)移。說明在腫瘤發(fā)生、生長和遷移等不同過程中腫瘤干細(xì)胞的特性和功能也不斷發(fā)生著改變，從而有利于腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和躲避治療。

4 腫瘤干細(xì)胞的分離純化

腫瘤干細(xì)胞的研究可能會在根治腫瘤和解決腫瘤的復(fù)發(fā)等問題上發(fā)揮重要作用。然而在腫瘤組織或細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞所占比例非常小，一般只占到總細(xì)胞數(shù)的0.01% ～2%，使得腫瘤干細(xì)胞的分離比較困難。目前常用如下幾種腫瘤干細(xì)胞分離方法。

4.1 利用腫瘤干細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物進(jìn)行分離

通過將腫瘤干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物與相應(yīng)的單克隆抗體或熒光素標(biāo)記物結(jié)合，再應(yīng)用一些分離技術(shù)手段將腫瘤干細(xì)胞分離、篩選出來的方法?？煞譃榇判曰罨?xì)胞分離法和熒光活化細(xì)胞技術(shù)分離法兩種。

4.1.1 磁性活化細(xì)胞分離法(免疫磁珠分選法，magnetic activated cell sorting，MACS)

MACS是基于腫瘤干細(xì)胞表面特異性抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，之后在外部磁場的作用下，連接有單克隆抗體磁珠的腫瘤干細(xì)胞停留在磁場中，而無特異性表面抗原的腫瘤細(xì)胞則不能與免疫磁珠結(jié)合，因而不能在磁場中停留，從而得以分離出腫瘤干細(xì)胞。

MACS是目前比較常用的分離腫瘤干細(xì)胞的技術(shù)手段，特別是在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離上應(yīng)用較多。2008年，董強(qiáng)剛等［24］利用該方法從人肺腺癌細(xì)胞株A549和SPC-A1中成功分離出表型為CD24+/IGF-1R+的肺腺癌干細(xì)胞。MACS對設(shè)備要求相對較抵，所獲得的目的細(xì)胞純度高(純度一般可達(dá)到90%以上)，且對細(xì)胞損傷小，不影響細(xì)胞活性和功能。

4.1.2 熒光活化細(xì)胞分選法(流式細(xì)胞分選法，fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)

FACS是通過將待分選的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞用同一種或多種熒光素標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記，根據(jù)腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體能力的差異，通過流式細(xì)胞儀將腫瘤干細(xì)胞分選出來的方法。

第一位從人類急性粒細(xì)胞白血病的研究中分離出白血病干細(xì)胞的Bonnet等［6］就是通過FACS獲得白血病干細(xì)胞的。FACS技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的腫瘤干細(xì)胞分離方法，具有特異性和敏感性均非常強(qiáng)的特點(diǎn)，但由于成本、設(shè)備和技術(shù)要求較高，且容易對細(xì)胞造成損傷，因此限制了該方法在國內(nèi)的廣泛應(yīng)用。

4.2 根據(jù)生物學(xué)特性分離腫瘤干細(xì)胞

根據(jù)腫瘤干細(xì)胞具有的某些生物學(xué)特性將腫瘤干細(xì)胞分離篩選出的方法。如可以通過細(xì)胞核對核染料的拒染性質(zhì)、腫瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的特殊條件等特性，分離出腫瘤干細(xì)胞。

4.2.1 旁群細(xì)胞(side population，SP)分選法

腫瘤干細(xì)胞具有對核染料Hoechst 33342拒染的特性，研究人員針對這一特性而建立了SP分選法，經(jīng)研究證實(shí)，這些分離出的旁群細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞樣性質(zhì)［25］。

Hoechst 33342是一種核酸染料，在紫外光激發(fā)下可發(fā)出藍(lán)色熒光(波長450 nm左右)和紅色熒光(波長650 nm左右)，腫瘤干細(xì)胞可將染料外排，而不發(fā)出熒光，從而可將這類旁群細(xì)胞分離出來。

Kondo等［26］證明大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中存在旁群細(xì)胞，并在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤、MCF-7乳腺癌、B104成神經(jīng)細(xì)胞瘤和HeLa腫瘤細(xì)胞系中成功分離出旁群細(xì)胞亞群，且這些旁群細(xì)胞具有與腫瘤干細(xì)胞相同的表面標(biāo)志物，多向分化和少量成瘤的特性，從而證實(shí)旁群細(xì)胞是適用于腫瘤干細(xì)胞分離的一種方法。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2高表達(dá)的細(xì)胞可高效外排Hoechst 33342，從而用流式細(xì)胞儀分選出對Hoechst 33342拒染的SP細(xì)胞，旁群細(xì)胞分選法對于仍未有表面標(biāo)志物研究的腫瘤干細(xì)胞的分離具有非常重要的意義。

4.2.2 無血清培養(yǎng)基(serum-free medium，SFM)分選法

研究人員發(fā)現(xiàn)，在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生長因子和細(xì)胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于缺乏生長所必須的血清成分而停止生長，經(jīng)長時間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細(xì)胞則可以在含特定生長因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長，經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞球，這種腫瘤干細(xì)胞的分離方法就是SFM分選法。

2003 年，Hemmati等［27］和 Singh 等［28］通過無血清培養(yǎng)的方法從腦膠質(zhì)瘤和成髓細(xì)胞瘤等腦腫瘤細(xì)胞中成功分離培養(yǎng)出了腦腫瘤細(xì)胞球，后被證實(shí)為腦腫瘤干細(xì)胞。

經(jīng)過證實(shí)可以在含有 B27(1∶50)、EGF(20 ng·ml-1)、bFGF(10 ng·ml-1)的DMEM/F12(1∶1)無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞系，可以培養(yǎng)分離出結(jié)腸癌干細(xì)胞球。這種方法具有操作簡便，對設(shè)備要求較低等優(yōu)點(diǎn)，但獲得的腫瘤干細(xì)胞純度較低，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行進(jìn)一步純化。

4.3 聯(lián)合運(yùn)用多種方法分離腫瘤干細(xì)胞

在目前的研究中，腫瘤干細(xì)胞的分離并不是采用單一的方法，而是選用兩種或者兩種以上的分離方法，以獲得數(shù)量更多、純度更高的腫瘤干細(xì)胞。如只運(yùn)用FACS技術(shù)時，雖然能分離出腫瘤干細(xì)胞，但是其數(shù)量不是很多，不易擴(kuò)大培養(yǎng)，而單采用SFM分離法時，雖然經(jīng)過幾代的培養(yǎng)能夠獲得較多腫瘤細(xì)胞球，但其周期長，且其中會含有非腫瘤干細(xì)胞，因此，其純度就無法得到研究的要求。因此，可以通過無血清培養(yǎng)法，將腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)至一定數(shù)量之后，再利用FACS技術(shù)或MACS技術(shù)對所獲得的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的分離和篩選，這樣所獲得的腫瘤干細(xì)胞在數(shù)量和純度上均能滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。

5 腫瘤干細(xì)胞的鑒定

腫瘤干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞之間雖有區(qū)別，但也具有很大的相似性，因此，分離出來的腫瘤干細(xì)胞必須經(jīng)過鑒定才能確認(rèn)。

5.1 利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定

目前，腫瘤干細(xì)胞最為廣泛且可靠的鑒定方法就是利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。將分離出的腫瘤干細(xì)胞通過免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞檢測技術(shù)等方法測定陽性或陰性細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況，進(jìn)而鑒定是否是腫瘤干細(xì)胞。因此，科學(xué)地探尋腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物對于腫瘤干細(xì)胞的分離和鑒定十分重要，確定腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的一般原則為結(jié)合譜系標(biāo)志、正常干細(xì)胞的特異標(biāo)志和正常組織特異性標(biāo)志等的綜合評價。表1為幾種已鑒定出的腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。

表1 腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物

5.2 異種移植成瘤性實(shí)驗(yàn)鑒定腫瘤干細(xì)胞

將分離出的腫瘤干細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后種植到異種動物體內(nèi)，如將人的腫瘤干細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠體內(nèi)，觀察其能否形成腫瘤病灶，且異種動物體內(nèi)形成的腫瘤病灶在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與原發(fā)腫瘤病灶類似，則可鑒定為腫瘤干細(xì)胞。一般來說，腫瘤干細(xì)胞形成腫瘤病灶所需的細(xì)胞密度比普通腫瘤細(xì)胞要小，如普通的腫瘤細(xì)胞接種密度必須達(dá)到1×109～1×1010L-1才能形成腫瘤，而腫瘤干細(xì)胞根據(jù)其純度接種密度達(dá)到1×106～1×109L-1即可形成腫瘤。從形成的腫瘤病灶中提取腫瘤干細(xì)胞，再次種植到免疫缺陷動物體內(nèi)后，仍可以形成腫瘤病灶，這種連續(xù)的異種動物致瘤能力說明這類細(xì)胞具有穩(wěn)定的自我更新能力和致瘤能力，從而可進(jìn)一步鑒定為腫瘤干細(xì)胞的。這些現(xiàn)象也證明了腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的形成和增殖過程中發(fā)揮的重要作用。腫瘤干細(xì)胞在異種動物體內(nèi)的連續(xù)成瘤實(shí)驗(yàn)是鑒定腫瘤干細(xì)胞最為可靠的鑒定方法。

5.3 腫瘤干細(xì)胞的其他鑒定方法

對于腫瘤干細(xì)胞的鑒定，還可通過腫瘤干細(xì)胞具有的類干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。如根據(jù)腫瘤干細(xì)胞核對核染料拒染(如Hoechst 33342染料)的性質(zhì)進(jìn)行鑒定［25］、根據(jù)腫瘤干細(xì)胞長期處于靜止?fàn)顟B(tài)的特性，應(yīng)用溴脫氧尿嘧啶核苷法進(jìn)行鑒定［47］和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)鑒定［4-5］等方法。

6 腫瘤干細(xì)胞研究前景

雖然經(jīng)過深入研究對腫瘤干細(xì)胞有了更深的認(rèn)識，但在研究中也仍面臨著不少難題:①雖然已成功分離出了幾種類型的腫瘤干細(xì)胞，但其分離和鑒定方法尚不完善，分離效率比較低;②多數(shù)腫瘤干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物還不是很清楚，腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定還是僅限于少數(shù)幾種腫瘤細(xì)胞;③腫瘤干細(xì)胞的離體研究忽略了腫瘤干細(xì)胞與腫瘤組織周圍環(huán)境間的相互影響;④分離出的腫瘤干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，容易分化成腫瘤細(xì)胞，如何保持腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性也是研究人員面臨的問題;⑤ 在腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)中長期使用蛋白水解酶可能影響細(xì)胞表面分子的表達(dá)，影響進(jìn)一步的研究。

腫瘤干細(xì)胞理論仍然存在不少的爭議和研究難點(diǎn)，但該理論的提出不僅豐富了傳統(tǒng)的腫瘤理論，還給研究腫瘤發(fā)生機(jī)制和治療策略的人們提供了新的思路和研究途徑，提示治療腫瘤時不能只殺傷腫瘤細(xì)胞，而是應(yīng)該同時采取相應(yīng)的治療手段殺傷腫瘤干細(xì)胞，從而達(dá)到根治腫瘤的目的。并且有望闡明腫瘤的發(fā)病和生長增殖機(jī)制，尤其在研究腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡性復(fù)發(fā)等問題有望發(fā)揮重大作用。

腫瘤干細(xì)胞分離和鑒定方法的不斷發(fā)展是這一理論走向應(yīng)用過程中邁出的第一步。在這一基礎(chǔ)上，對腫瘤干細(xì)胞的進(jìn)一步研究(包括腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征、尋找腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物、腫瘤干細(xì)胞形成或自我更新等生理過程中的關(guān)鍵蛋白等)不僅有助于實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，還可通過將腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物、增殖過程中所必須的酶類、細(xì)胞自我更新過程中的主要信號通路蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、miRNAs等作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)出能抑制和殺傷腫瘤干細(xì)胞的治療手段，從而最終達(dá)到根治腫瘤的目的。

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