人參總皂苷與丹參總酚酸配伍對急性血瘀大鼠血液流變性的改善作用

張 可，馬 旭，2，韓淑燕，3，馬治中，屠鵬飛

(1.北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191;2.國家知識產(chǎn)權局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100083;3.北京大學臨床腫瘤學院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發(fā)病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

臨床研究資料表明，心肌缺血患者存在不同程度的血液流變異常。冠心病在中醫(yī)學中屬“胸痹”范疇。中醫(yī)理論認為，氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣滯則血凝，氣虛則行血無力，導致血流緩慢甚至停滯，氣虛氣滯均可致血瘀。因此，血液流變各項指標也是中藥研究的重要觀測內(nèi)容，特別是在中醫(yī)血瘀證的藥理研究中有重要意義［1-2］。已往研究表明，人參作為傳統(tǒng)的補氣藥，其單味藥及制劑可防止急性心肌梗死時冠狀動脈的高黏狀態(tài)，預防血栓形成以及動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展，人參Rb皂苷對急性血瘀模型大鼠血液黏度、血小板聚集和血液流變的異常變化具有明顯改善作用［3］。丹參及其制劑可抑制二磷酸腺苷(ADP)和腎上腺素誘導的人或兔血小板聚集，體外給藥亦可抑制大鼠血小板血栓形成時間和纖維蛋白血栓形成時間，降低全血黏度、血漿黏度和纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)含量等［4-6］。人參總皂苷(saponins of Panax ginseng，EPG)是其發(fā)揮藥效的主要活性成分，丹參總酚酸(phenolic acids of Salvia miltiorrhiza，ESM)是丹參中的主要活性成分，均具有改善血液流變異常的作用。雖然關于人參和丹參在改善血液流變方面的研究頗多，但二者的配伍研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究以中醫(yī)“氣血理論”為指導，以益氣藥人參和活血藥丹參為研究對象，觀察EPG與ESM配伍對血液流變異常的改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

EPG為本實驗室自制，制備工藝為:人參飲片加60%乙醇加熱回流提取4次，加醇量依次為6，4，4和4倍體積，提取時間每次均為0.5 h，合并提取液，回收乙醇后過HPD-100大孔吸附樹脂，先用6倍柱體積水洗脫，繼用8倍柱體積20%乙醇洗脫，再用6倍柱體積60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，濃縮，真空干燥，即得EPG，其中含人參皂苷Rg110.34%，人參皂苷Re 4.13%，人參皂苷Rg21.40%，人參皂苷Rb116.9%，人參皂苷 Rc 6.83%，人參皂苷 Rb24.73%，人參皂苷 Rb30.65%，人參皂苷 Rd 2.55%。

ESM為本實驗室自制，制備工藝為:丹參去雜質(zhì)，切成0.5 cm左右小段，加8倍體積去離子水80℃加熱提取1 h，濾過，濾液備用，藥渣再加6倍體積去離子水80℃加熱提取2次，每次0.5 h，濾過，合并3次濾液，60℃以下減壓濃縮至相對密度為1.25～1.30(50℃)，冷卻至室溫后加95%乙醇至含醇量達80%，靜置12 h，濾過，回收乙醇，并濃縮至相對密度為1.25～1.30(50℃)，通過大孔吸附樹脂AB-8(生藥量與樹脂比例為1∶4)，用去離子水洗至流出液無糖反應，約5倍藥材量;繼續(xù)用40%乙醇洗脫，從色帶下來開始收集洗脫液，直至洗脫液加三氯化鐵和鐵氰化鉀試劑不變綠并無沉淀為止，約8倍藥材量，將洗脫液于60℃以下減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.25～1.30(50℃)，噴霧干燥，即得ESM，其中含丹酚酸B 41.5%，丹參素2.32%，原兒茶醛4.74%，迷迭香酸4.53%，紫草酸1.91%。

阿司匹林腸溶片，購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號:BTA6E93;鹽酸腎上腺素10 mg·L-1注射液，購自天津市氨基酸公司，批號:20070612;凝血酶時間(thrombin time，TT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和Fib含量測定試劑盒均購自北京中勤世帝科學儀器有限公司;二磷酸腺苷，購自中國科學院上海生物化學研究所。

LG-R-80B型血液黏度儀和血小板聚集凝血因子分析儀，北京中勤世帝科學儀器有限公司;TGL-16G A冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;3F-2型多功能微量高速離心機，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學航空工業(yè)部華興航空機輪公司。

1.2 動物和急性血瘀模型的制備

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量240～280 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，合格證號為SCXK(京)2002-0001。大鼠sc給予腎上腺素0.8 mg·kg-1共2次，間隔時間為4 h。第1次sc給予腎上腺素 0.8 mg·kg-1后 2 h，將大鼠置于0℃冰水中游泳5 min，2 h后再第2次sc給予腎上腺素 0.8 mg·kg-1，造成大鼠急性血瘀癥［7］。

1.3 動物分組和給藥

將大鼠隨機分為6組，每組10只，即正常對照、模型、阿司匹林 100 mg·kg-1(陽性對照)、EPG 200 mg·kg-1、ESM 200 mg·kg-1和 EPG 200 mg·kg-1+ESM 200 mg·kg-1組。大鼠ig給予相應藥物，正常對照和模型組大鼠ig給予等體積的空白溶劑，每天早晚各1次，共7次。于第5次給藥后，除正常對照組sc給予生理鹽水外，其余各組大鼠按1.2的方法造成大鼠急性血瘀癥后，禁食16～18 h，期間給第6次和第7次藥。最后1次給藥后30 min腹主動脈取血，肝素鈉20 kU·L-1抗凝血用于全血黏度、血漿黏度和血細胞比容的測定，3.8%枸櫞酸鈉抗凝血 (枸櫞酸鈉∶全血為1∶9，V/V)用于APTT，TT，PT 和 Fib及血小板聚集的測定。

1.4 全血黏度和血漿黏度的測定

以錐板式旋轉黏度計測定大鼠全血黏度。取肝素抗凝的0.8 ml全血加入血液黏度計的樣品池中，于37℃測定切變率200，100，50和1 s-1下的全血黏度，并計算紅細胞聚集指數(shù)(erythrocyte aggregation index，EAI)，即 EAI= ηa1/ηa100，其中 ηa1是切變率 1 s-1下的全血黏度，ηa100是切變率100 s-1下的全血黏度［8］。

取2 ml肝素抗凝血，3000×g離心15 min，取0.8 ml血漿于37℃測定血漿黏度。

1.5 比濁法測定血小板聚集性

取枸櫞酸鈉抗凝血2 ml，800×g離心10 min，制備富血小板血漿;再以2500×g離心10 min，制備貧血小板血漿，調(diào)節(jié)血小板密度250×109L-1，以ADP終濃度5 μmol·L-1為血小板聚集誘導劑，采用比濁法于37℃測定血小板最大聚集率。

1.6 APTT，TT，PT和Fib含量的測定

取枸櫞酸鈉抗凝血1 ml，3000×g離心15 min，取上層血漿，采用血小板聚集凝血因子分析儀，按測定試劑盒說明的方法于37℃測定APTT，TT，PT和Fib含量。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 EPG與ESM配伍對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響

表1結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠切變率在200，100，50和1 s-1下的全血黏度和血漿黏度明顯增高(P＜0.01)。與血瘀模型組相比，單獨給予 EPG 200 mg·kg-1、單獨給予 ESM 200 mg·kg-1及 EPG 200 mg·kg-1與 ESM 200 mg·kg-1配伍均可顯著降低全血黏度和血漿黏度 (P＜0.05，P＜0.01)，EPG與ESM配伍組與 EPG或ESM單獨使用組相比無統(tǒng)計學差異。

Tab.1 Effect of extract of P.ginseng saponins(EPG)and S.miltiorrhiza phenolic acids(ESM)alone or in combination on whole blood and plasma viscosity in rats with blood stasis

2.2 EPG與ESM配伍對急性血瘀大鼠血小板聚集的影響

表2結果顯示，與正常對照組相比，血瘀模型組大鼠的血小板聚集率明顯增加 (P＜0.01)。與模型組相比，EPG 200 mg·kg-1單獨使用不能顯著降低血小板聚集，ESM 200 mg·kg-1單獨使用以及EPG與ESM配伍均可顯著降低血小板聚集 (P＜0.01)，與ESM單用相比，EPG與ESM配伍抑制血小板聚集的作用無顯著性差異，而與EPG單用相比，EPG與ESM配伍組能顯著降低血小板最大聚集率(P ＜0.05)。

Tab.2 Effect of EPG and ESM alone or in combination on platelet maximum rate in rats with blood stasis

2.3 EPG與ESM配伍對急性血瘀大鼠凝血參數(shù)的影響

表3結果顯示，與正常對照組相比，急性血瘀模型組 Fib含量升高，APTT，TT和 PT顯著縮短(P ＜0.01)。與模型組相比，EPG 200 mg·kg-1能顯著降低 Fib含量，顯著延長APTT，PT和TT(P＜0.05);ESM 200 mg·kg-1能顯著降低 Fib 含量，顯著延長APTT(P＜0.05)，但對PT和TT無明顯影響。與EPG單用和ESM單用相比，EPG與ESM配伍能顯著降低Fib的含量(P＜0.05)。EPG與ESM配伍組在降低Fib含量、延長APTT和TT方面與陽性對照阿司匹林相似。

Tab.3 Effect of EPG and ESM alone or in combination on fibrinogen(Fib)，activated partial thrombin time(APTT)，thrombin time(TT)and prothrombin time(PT)in rats with blood stasis

3 討論

心肌缺血患者存在不同程度血液流變的異常，主要表現(xiàn)在Fib、血漿黏度、全血黏度和紅細胞聚集指數(shù)升高，纖溶活性和紅細胞變形下降。血液黏度的增高會引起血流阻力增強，使血流速度減慢，最后導致血流停滯，直接影響臟器血液供應，導致疾病。血液黏度主要受血漿中分子成分的影響，其中Fib是影響血漿黏度和全血黏度的主要因素之一。Fib分子為纖維狀，容易彎曲，引起分子間牽連而血液黏度增大，同時Fib通過橋聯(lián)作用連接鄰近紅細胞，使之成為可逆性緡錢簇狀的一堆聚集體，導致紅細胞聚集性顯著增高，原來不易聚集的部位，如微動脈或毛細血管近動脈段，也可出現(xiàn)紅細胞聚集體。當紅細胞膜的彈性減低，而剛性指標增高，紅細胞變硬變脆，造成組織灌注不良、缺氧和酸中毒，引起血小板聚集，這些結果又反過來加重血液黏度的增高，聚集性增高，造成惡性循環(huán)［2］。血小板是一種具有黏附、聚集和釋放等多項功能的細胞。在機體止血和保護血管內(nèi)皮完整性過程中起著重要作用。心肌缺血時血小板功能亢進，形成微血栓，阻塞血流，是引起組織缺血再灌注損傷加重的重要因素。APTT可反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況;PT反映外源性凝血系統(tǒng)因子的凝血狀況。

本研究采用強迫游泳法讓大鼠游泳，使大鼠處于高度應激狀態(tài)，造成大鼠體力逐步衰弱，模擬中醫(yī)所說的極度勞倦所致氣虛證的發(fā)生過程而導致大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氣虛血瘀，同時腹腔注射腎上腺素致大鼠心肌缺血而得到“氣虛血瘀證”心肌缺血大鼠模型。研究結果表明，模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、Fib含量和血小板聚集等均顯著高于正常對照組，而APTT，TT和PT則明顯低于正常對照組。EPG和ESM單獨使用均可顯著降低“氣虛血瘀證”心肌缺血大鼠的全血黏度、血漿黏度和Fib含量，顯著延長APTT，其中ESM還能顯著降低血小板最大聚集率，EPG能顯著延長TT和PT。EPG+ESM配伍改善血液流變多項指標的作用均優(yōu)于EPG和ESM單獨使用，其中在降低血小板最大聚集率方面顯著優(yōu)于EPG單用，在延長TT方面顯著優(yōu)于ESM單用，在降低Fib含量上則顯著優(yōu)于EPG單用和ESM單用。EPG+ESM配伍對血液流變異常的改善作用與阿司匹林相似。由此可見，EPG和ESM單用及其配伍均能改善血瘀模型大鼠血液流變的異常，但二者配伍后能進一步增強對血瘀模型大鼠血液流變異常的改善作用。

綜上所述，EPG和ESM單用及其配伍均具有糾正血液流變異常的作用，且配伍組的作用優(yōu)于EPG和ESM單用，進一步提示在改善血瘀大鼠的血液流變方面二者可以補氣活血，氣血雙補，為臨床上聯(lián)合應用補氣藥和活血藥進行疾病的治療提供實驗依據(jù)。

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