去甲斑蝥素對體外微管蛋白聚合的抑制作用

洪興福，李寶賽，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院生物制藥系，北京 100102)

微管存在于幾乎所有真核細胞中，是構成細胞骨架的主要成分之一，由微管蛋白和微管相關蛋白構成，可以通過其亞單位的組裝和去組裝改變其長度或存在狀態(tài)。微管在維持細胞形態(tài)、參與細胞運動、錨定細胞器位置和運輸細胞內物質中起著非常重要的作用。特別是在細胞有絲分裂的過程中，當細胞由分裂間期進入分裂期后，細胞質中的微管解聚成微管蛋白，參與紡錘體的裝配，介導染色體的運動;分裂進入末期后，紡錘體解聚形成游離的微管蛋白，重新參與細胞間期微管的組裝。干擾微管蛋白聚合-解聚過程的藥物，往往會阻滯細胞周期進程，進而引起細胞凋亡，因此，以微管為靶點的藥物，一直都是研究抗癌藥物的熱點。

為了更好地研究微管蛋白聚合-解聚的條件以及藥物對微管蛋白聚合-解聚的影響，科學家利用微管蛋白具有在37℃條件下聚合，而在0℃條件下解聚的特點，從動物的腦組織勻漿中提取微管蛋白，向微管蛋白中加入Mg2+，GTP(或ATP)和EDTA，實現了微管蛋白在離體條件下的組裝與去組裝，該實驗體系已成為篩選和研究以微管為靶點的抗癌藥物的重要手段［1-3］。

去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)系斑蝥素(cantharidin)的結構同類物，與斑蝥素相比，缺少1，2位兩個甲基，立體構型相同，是經人工全合成的一種新型低毒的抗癌藥物，目前主要用于消化道腫瘤和肺癌的治療［4］。我們體外實驗表明NCTD具有廣譜抗癌活性，特別對轉移性卵巢癌細胞系SK-OV-3等有較強的生長抑制作用。NCTD能夠嚴重干擾腫瘤細胞的有絲分裂，使紡錘體形成紊亂，引起細胞有絲分裂期阻滯，但阻滯機制不清楚［5-6］。已知一些抗癌藥物如紫杉醇、秋水仙堿等主要通過影響微管蛋白的聚合-解聚過程，擾亂細胞的有絲分裂，從而發(fā)揮其抗癌作用［2-3］。本研究主要利用體外微管蛋白聚合-解聚反應體系，研究NCTD對微管蛋白的聚合-解聚過程的影響，并通過 NCTD敏感細胞系SK-OV-3進行了初步的細胞水平的驗證。

1 材料與方法

1.1 化合物和試劑

NCTD購于Sigma公司，使用前用無菌雙蒸水配成10 mmol·L-1的母液，-20℃保存，用前用無菌雙蒸水稀釋。2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、EGTA、ATPNa2、秋水仙堿、紫杉醇和考馬斯亮藍R250購于Sigma公司;丙三醇、甲醇、冰醋酸、MgCl2和 NaOH等為國產分析純。兔抗α-微管蛋白 購自Epitomics公司;ECL試劑盒為Thermo Scientific公司產品。

1.2 微管蛋白的制備

參照文獻［1，7］提取微管蛋白的方法，略有改進。將成年豬腦置于冰上，剝去腦膜和大血管，用冷的MES 緩沖液(MES 0.1 mol·L-1，EGTA 0.1 mol·L-1，ATPNa21.0 mmol·L-1，MgCl20.1 mol·L-1，用 NaOH調pH 6.5)洗2次，然后將腦組織剪碎，每克腦組織加入1 ml MES緩沖液，在4℃條件下，用電動勻漿器將其制成勻漿。

將腦組織勻漿在4℃，105000×g條件下離心1 h，取上清液，加入等體積的 MES聚合緩沖液(MES 0.1 mol·L-1，EGTA 0.1 mol·L-1，ATPNa21.0 mmol·L-1，MgCl20.1 mol· L-1，丙 三 醇8.0 mmol·L-1，用 NaOH 調 pH 6.5)，置37℃水浴保溫30 min，期間輕輕振搖數次，在26℃，105000×g條件下離心1 h，棄上清，用約1/10勻漿體積的預冷MES緩沖液將沉淀物分散，置于冰浴中30 min，使沉淀物基本溶解。再重復低溫和高溫離心各1次，將離心得到的沉淀物，用少量預冷的 MES緩沖液在冰浴中將其溶解，得到微管蛋白溶液，置液氮中保存?zhèn)溆?。?Bradford法測定微管蛋白含量［8］。

1.3 微管蛋白的鑒定

常規(guī)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1%考馬斯亮藍R250染色10 min，脫色過夜。

1.4 最佳聚合微管蛋白濃度的確定

在冰浴的 96孔板中加入 5μl ATPNa240 mmol·L-1，然后加入已純化的不同濃度微管蛋白195 μl，使其終濃度分別為 5.6，2.8，1.4 和0.7 g·L-1。在4℃于酶標儀350 nm 處迅速調零，放入37℃水浴中恒溫25 min，開始時每隔1～3 min測定吸光度(absorbance，A350nm)1次，10 min后每隔5 min測1次，根據所測得的A530nm的變化繪制微管蛋白聚合曲線，確定微管蛋白聚合的合適濃度。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.5 微管蛋白聚合和解聚動態(tài)平衡反應

參照文獻［9］，在冰浴的96孔板中加入5 μl ATPNa240 mmol·L-1，然后 加 入 195 μl 濃 度 為5.74 g·L-1的微管蛋白，使其終濃度為 5.6 g·L-1。在4℃于350 nm處迅速調零，放入37℃水浴中恒溫25～30 min，開始時每隔 1～3 min測定 A530nm，10 min后每隔5 min測定，根據所測得的A530nm的變化繪制微管蛋白聚合曲線。當聚合曲線進入穩(wěn)定高平臺期時，說明微管蛋白聚合-解聚達到動態(tài)平衡，吸光度不再發(fā)生顯著的變化，聚合反應基本結束，然后，將比色皿放入4℃冰浴中25 min左右，開始時每隔1～3 min測定 A530nm，10 min后每隔5 min測定，根據所測得的A530nm的變化繪制微管蛋白解聚曲線。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 Bradford法檢測微管蛋白聚合-解聚活性

在上述微管蛋白聚合-解聚的反應體系中實驗組加入終濃度分別為 10，20 和 30 μmol·L-1的NCTD;參照文獻［9］，陽性對照組分別加入終濃度為 2 μmol·L-1的紫杉醇和 4 μmol·L-1的秋水仙堿;空白對照組加入無菌三蒸水，按照1.5中測量方法記錄A530nm值的連續(xù)變化。每組設3個復孔，實驗重復3次。抑制率(%)=(1-實驗組A350nm/空白對照組A350nm)×100%

1.7 Western印跡法檢測SK-OV-3細胞中微管蛋白蛋白含量

對數生長期的人卵巢癌SK-OV-3細胞(購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫，本實驗室凍存)，NCTD 60 μmol·L-1作用 8 h，分別收集對照組和藥物處理組細胞，細胞計數，取相同數量的對照組和藥物處理組細胞兩份，細胞裂解液裂解，分別做下列實驗:一份直接Western印跡法檢測對照組和藥物處理組SK-OV-3細胞中總微管蛋白含量［10］。另一份13000×g離心10 min，分別取上清(代表游離未聚合的微管蛋白)和沉淀(代表聚合的微管蛋白)，Western印跡法檢測SK-OV-3細胞內未聚合的微管蛋白和聚合的微管蛋白的含量。Western印跡實驗結果掃描后用 Quantity One(Bio-Rad公司)軟件分析求半定量數據。比較加藥組微管蛋白含量及對照組微管蛋白含量，計算微管蛋白含量的變化。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 微管蛋白含量測定及微管蛋白聚合-解聚體系的建立

Bradford法測定提取的微管蛋白含量為22 g·L-1，SDS-PAGE顯示蛋白樣品的主要組分的分子質量在55 ku左右，這與文獻報道的相符，用凝膠定量分析軟件Gel-Pro Analyzer Version 4.0計算微管蛋白純度約為85%。

在4組不同濃度的微管蛋白聚合曲線(圖1)中，微管蛋白濃度為5.6 g·L-1時的聚合曲線與參考文獻中微管蛋白標準聚合曲線一致［7］，滿足實驗要求，故選取這個濃度作為以后實驗濃度。

Fig.1 Polymerization of different concentration of tubulin at 37℃ from 0 to 30 min.

提取的微管蛋白在37℃水浴條件下聚合(0～25 min)，在4℃冰浴條件下解聚(25～50 min)，能夠隨溫度的變化而發(fā)生聚合-解聚(圖2)，說明本實驗提取的微管蛋白具有良好的活性。

Fig.2 Polymerization of tubulin 5.6 g·L－1from 0 to 25 min at 37℃and depolymerization from 25 to 50 min at 4℃.

2.2 NCTD對微管蛋白聚合-解聚活性的影響

由圖3可見，紫杉醇明顯地抑制微管蛋白的解聚，且始終保持在聚合的穩(wěn)定狀態(tài)，而秋水仙堿在37℃水浴時，能夠顯著地抑制微管蛋白的聚合。

由圖4可見，與空白對照相比，NCTD在0～30 μmol·L-1范圍內，在 37℃ 聚合反應中，隨濃度的升高抑制作用增強(P ＜0.05)，NCTD 10，20和30 μmol·L-1組對微管蛋白聚合的抑制率分別為(5.5 ±2.7)%，(7.1 ±1.2)%和(27.5 ±0.4)%，但對微管蛋白在4℃的解聚影響不顯著。

Fig.3 Effect of colchicine and paclitaxel on tubulin polymerization.

Fig.4 Effect of NCTD on tubulin polymerization(37℃)and depolymerization(4℃).

2.3 NCTD對SK-OV-3細胞中微管蛋白聚合的影響

NCTD 60 μmol·L-1作用人卵巢癌 SK-OV-3 細胞8 h后，與空白對照組相比細胞中總的微管蛋白含量上升了(26.3 ±4.1)%(P ＜0.01)(圖 5A);而細胞中游離的微管蛋白上升了(91.5±8.5)%(P＜0.01)(圖5B);聚合微管蛋白量減少了(51.8±3.8)%(P ＜0.01)(圖5C)。表明 NCTD 對細胞內微管蛋白的聚合有明顯的抑制作用。

Fig.5 Effect of NCTD on tubulin polymerization in SK-OV-3 cells.NCTD 60 μmol·L-1treated cells for 8 h.A:total tubulin;B:free tubulin;C:polymeric tubulin.Lane 1:normal control group;lane 2:NCTD 60 μmol·L-1group.

3 討論

本研究發(fā)現，NCTD對微管蛋白的聚合具有明顯的抑制作用，體外條件下在一定濃度范圍內(0～30 μmol·L-1)隨濃度的升高抑制作用增強。由于微管蛋白參與有絲分裂過程中紡錘體的形成，介導染色體的運動，當微管蛋白的聚合作用被抑制時，藥物可能會破壞紡錘體的形成，進而影響有絲分裂的進程并致使腫瘤細胞增殖受阻。但體外實驗中也發(fā)現，繼續(xù)增加NCTD的濃度，對微管蛋白的抑制作用并沒有繼續(xù)增強(結果中未顯示)，是NCTD與微管蛋白的結合有飽和效應，還是高濃度的NCTD改變了微管蛋白的構象，進一步影響了微管蛋白的聚合過程，目前還不清楚。

另外，本實驗的前期工作表明，NCTD在一定濃度范圍可以有效地抑制SK-OV-3細胞生長和誘導細胞凋亡，本研究所用 60 μmol·L-1濃度在藥物有效范圍內，目前雖發(fā)現在此濃度下NCTD對細胞內微管蛋白的聚合有抑制作用，但NCTD的這種作用與細胞死亡之間的確切聯系還需要進一步的實驗數據來證明。

NCTD對微管蛋白的作用與秋水仙堿一樣，主要抑制微管蛋白的聚合，但秋水仙堿的抑制作用遠強于NCTD。有研究用14C標記的秋水仙堿類似物和內源酶消化的方法發(fā)現，秋水仙堿結合于β微管蛋白的1～36和214～241的兩個殘基區(qū)段［11］，NCTD 是否與微管蛋白存在特異性結合位點，是否可以采取相似的方法進行研究，還需要進一步研究。

為了進一步探討NCTD結構與其抑制微管蛋白作用之間的相關性，我們也考察了其結構同類物斑蝥素對微管蛋白聚合-解聚的影響，結果發(fā)現，斑蝥素體外對微管蛋白的抑制作用與NCTD相似，在一定濃度范圍(0～20 μmol·L-1)內具濃度依賴的正相關效應，但同樣濃度抑制效應比NCTD弱(結果未顯示)。NCTD與斑蝥素相比，缺少1，2位兩個甲基，立體構型相同，說明斑蝥素的核心結構對微管蛋白聚合有抑制作用，而兩個甲基的存在卻削弱了斑蝥素與微管蛋白的結合。另外，細胞毒性實驗表明，斑蝥素對細胞的毒性大于NCTD，提示斑蝥素類藥物殺傷腫瘤細胞的途徑不僅僅是直接抑制微管聚合一條途徑。

已知斑蝥素和NCTD均為PP2A的抑制劑［12］，PP2A是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，具有多種生物學活性，是染色體分離時所需要的，有實驗表明，在細胞水平，斑蝥素能直接或間接與PP2A結合，引起紡錘體形成紊亂，造成有絲分裂期阻滯［6］。PP2A是否直接或間接影響微管蛋白的聚合還有待進一步研究。

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