高果糖飲食對大鼠腎臟的毒性作用

胡志娟，劉 冰，李 凡，孫 文，宋光耀*

(河北省人民醫(yī)院1.腎內(nèi)科;2.內(nèi)分泌科，河北石家莊 050051)

腎臟疾病中常伴有各種類型的脂質(zhì)代謝異常，且一直被認為是腎病造成的。1982年，Moorhead和同事提出脂質(zhì)腎毒性學(xué)說，認為在一些情況下，循環(huán)中的脂質(zhì)可能直接損害腎小球結(jié)構(gòu)，高脂血癥在啟動腎小球損害到腎小球硬化的過程中是一個重要的加重因素［1］。當(dāng)今飲食結(jié)構(gòu)的變化致使果糖的攝入量逐年增加。人體及動物實驗研究表明，果糖代謝所導(dǎo)致的三酰甘油的甘油和?；糠置黠@增多，從而使脂質(zhì)從頭合成以及三酰甘油合成的速率明顯增強［2］。果糖同葡萄糖相比，更能誘導(dǎo)固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和肝臟脂質(zhì)從頭合成［3］。本研究采用高果糖飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠高三酰甘油血癥，觀察腎組織脂質(zhì)的蓄積及腎臟病理形態(tài)的變化，探討脂質(zhì)腎毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組

清潔級雄性Wiatar大鼠32只，體質(zhì)量200 g左右，(河北醫(yī)科大學(xué)動物室提供，合格證號1003188)，隨機均分成正常對照組(N組)和高果糖組(F組)。正常對照組喂飼普通飼料，高果糖組中果糖占熱量的34.5%。每日記大鼠進食量，每周記大鼠體質(zhì)量。喂養(yǎng)8、16周時各處死大鼠8只，大鼠處死前1 d采用代謝籠收集24 h尿標(biāo)本，處死時留取血標(biāo)本。腎臟經(jīng)0.9%氯化鈉注射液充分灌洗后稱重，部分組織以10%甲醛固定、石蠟包埋，制成3 μm厚切片，其余組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生化測定

腹腔注射3%戊巴比妥麻醉各組大鼠(2 mL/100 g)，右側(cè)頸動脈取血標(biāo)本約8 mL。血肌酐、尿素氮、空腹血糖及血脂的測定在Beckman全自動生化分析儀上完成。24 h尿微量白蛋白定量采用免疫比濁法。

1.3 腎皮質(zhì)脂質(zhì)提取及三酰甘油測定

用0.1 mmol PBS緩沖液進行左腎灌洗，灌洗速度為10 mL/min，PBS總量為50 mL，灌洗后腎臟呈灰白色，分離腎皮質(zhì)，取200 mg皮質(zhì)按 Macala等［4］方法進行脂質(zhì)提取及定量分析。

1.4 腎組織病理檢測

經(jīng)10%甲醛固定的腎組織石蠟包埋，制成3 μm厚的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化行PAS染色。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測Ⅳ型膠原(Ⅳ-type collagen)、α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達

腎組織進行3 μm厚的連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.4%胃蛋白酶37℃孵育30 min(Ⅳ型膠原)，3%H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗2 min×3次;分別滴加兔抗Ⅳ型膠原抗體及兔抗α-SMA(武漢博士德公司)4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次;再依次加入聚合物輔助劑和辣根酶標(biāo)記的1∶100兔抗IgG工作液，37℃孵育20 min，每步后均PBS沖洗，2 min×3次。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片鏡檢。PBS(磷酸鹽)緩沖液替代一抗作陰性對照。免疫組化照片經(jīng)灰度掃描測定吸光度值 (A value)。

1.6 電鏡檢查

常規(guī)4%戊二醛固定腎組織、切片，電鏡下觀察大鼠腎小球基底膜。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 左腎質(zhì)量/體質(zhì)量、腎功能、血脂、空腹血糖及24 h尿微量白蛋白

三酰甘油、極低密度脂蛋白及24 h尿微量白蛋白在高果糖組明顯升高(P＜0.05)，且隨時間延長其水平均增加(表1)。

2.2 腎皮質(zhì)三酰甘油含量

與對照組比較，高果糖組腎皮質(zhì)三酰甘油含量明顯增加(P＜0.05)，且隨時間延長其水平均增加(表2)。

2.3 腎臟病理改變

高果糖組大鼠腎小球系膜細胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮空泡及顆粒變性，隨時間延長，病變加重，腎間質(zhì)及小血管未見明顯病變(圖1)。

2.4 腎組織Ⅳ型膠原、α-SMA的表達

與對照組比較，高果糖組大鼠Ⅳ型膠原在腎小球基底膜、系膜區(qū)的表達顯著升高(P＜0.01)，隨病程延長，表達增強。α-SMA僅在正常大鼠血管平滑肌細胞中表達;高果糖組大鼠腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)細胞可見陽性表達(P＜0.01)(表2，圖2，3)。

表1 各組大鼠左腎質(zhì)量/體質(zhì)量、腎功能、血脂、空腹血糖及24 h尿微量白蛋白Table 1 Left kidney weight/body weight，BUN，Scr，blood lipid，F(xiàn)PG and urinary microalbumin of 24 hours in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

表1 各組大鼠左腎質(zhì)量/體質(zhì)量、腎功能、血脂、空腹血糖及24 h尿微量白蛋白Table 1 Left kidney weight/body weight，BUN，Scr，blood lipid，F(xiàn)PG and urinary microalbumin of 24 hours in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

＊P＜0.05 compared with N group.

group time(weeks)KW/BW(×10－3)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)VLDL(mmol/L)FPG(mmol/L)24 hUMA(μg)N 8 3.11±0.27 6.46±0.50 33.75±3.28 1.50±0.210.79±0.31 0.40±0.14 5.19±0.58 20.00±6.00 16 3.34±0.56 6.59±1.37 41.39±6.39 1.66±0.14 1.09±0.36 0.50±0.16 5.45±0.47 45.00±24.00 F 8 3.38±0.22 6.54±0.66 42.56±8.25 1.59±0.20 1.65±0.86* 0.75±0.39* 5.84±0.56 63.00±12.00*16 3.63±0.41 6.69±0.85 45.57±3.67 1.82±0.65 2.13±0.87* 0.97±0.40* 6.01±0.37 150.00±48.00*

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色Fig 1 PAS staining in two groups by the end of 8 and 16 weeks(×200)

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)三酰甘油含量及腎組織Ⅳ型膠原、α-SMA的表達Table 2 Triglyceride of renal cortices，obsorbance ratio(A value)of Ⅳ-type collagen and α-SMA in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)三酰甘油含量及腎組織Ⅳ型膠原、α-SMA的表達Table 2 Triglyceride of renal cortices，obsorbance ratio(A value)of Ⅳ-type collagen and α-SMA in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with N group;#P＜0.05 compared with 8 weeks.

group time(weeks) TG of renal cortices(mg/g) Ⅳ-type collagen α-SMA N 8 4.30±0.76 0.316±0.017 0.109±0.011 16 5.16±1.70 0.325±0.015 0.115±0.012 F 8 7.21±2.20* 0.405±0.016＊＊ 0.218±0.013＊＊16 7.92±3.05* 0.427±0.017＊＊# 0.240±0.014＊＊#

圖4 各電鏡觀察各組大鼠腎小球基底膜Fig 4 Electron microscope for GBM in two groups by the end of 8 and 16 weeks(×20 000)

2.5 電鏡觀察腎小球基底膜

電鏡下，對照組大鼠腎小球基底膜內(nèi)疏松層、致密層、外疏松層結(jié)構(gòu)清晰，厚度均勻，可見內(nèi)皮細胞窗孔及足細胞突起。高果糖組腎小球基底膜彌漫增厚足細胞突起融合，內(nèi)皮細胞吞噬脂質(zhì)，隨病程延長，病變加重，未見電子致密物(圖4)。

3 討論

高果糖飲食主要導(dǎo)致兩方面的代謝影響:對葡萄糖的攝取和代謝的擾亂，以及脂質(zhì)從頭合成和三酰甘油合成速率的明顯增強。果糖對機體的危害有:肥胖、加速衰老、胰島素抵抗、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥(視網(wǎng)膜病變、腎臟疾病、神經(jīng)疾病)、非酒精性脂肪肝、高三酰甘油血癥、高尿酸血癥、慢性腹瀉、腸應(yīng)激綜合征、蕁麻疹［5］。隨著我國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高三酰甘油血癥的患病人數(shù)逐年增多，臨床上高三酰甘油血癥可導(dǎo)致脂、蛋白、糖代謝異常的相關(guān)報道已屢見不鮮［6］。

本研究中，經(jīng)過8周高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠高三酰甘油血癥及高極低密度脂蛋白血癥，而血糖水平無明顯升高;16周時，大鼠的上述指標(biāo)升高更為明顯而血糖水平仍無顯著差異，提示脂代謝紊亂往往出現(xiàn)在糖代謝紊亂之前。因此，脂代謝異常是糖代謝紊亂的驅(qū)動因素之一。

腎臟疾病時常常伴有高三酰甘油血癥，研究發(fā)現(xiàn)血清三酰甘油水平與尿蛋白排泄率、腎小球濾過率的下降具有顯著相關(guān)性［7］，提示三酰甘油以及富含三酰甘油的脂蛋白具有腎毒性作用［8－9］。

本研究發(fā)現(xiàn)，高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠不僅發(fā)生高三酰甘油血癥及高極低密度脂蛋白血癥，在腎皮質(zhì)亦出現(xiàn)三酰甘油的蓄積，表現(xiàn)在腎皮質(zhì)三酰甘油含量增加，隨時間延長，上述指標(biāo)水平升高。高果糖組大鼠在實驗8周時出現(xiàn)尿微量白蛋白水平顯著增加，該指標(biāo)是早期腎損害較為敏感的指標(biāo)，提示腎臟損傷。PAS染色可見高果糖組大鼠腎小球系膜細胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮空泡及顆粒變性，隨時間延長，病變加重，腎間質(zhì)及小血管未見明顯病變。免疫組織化學(xué)也表明，腎小球硬化的指標(biāo)-存在正常大鼠腎小球基底膜和系膜區(qū)的Ⅳ型膠原，在高果糖組表達增強;腎小管間質(zhì)纖維化的指標(biāo)僅在正常大鼠血管平滑肌細胞中表達的α-SMA，在高果糖組大鼠腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)表達，提示腎臟病變的進展。電鏡下，不僅可見腎小球基底膜增厚，足細胞突起融合，尚可見內(nèi)皮細胞吞噬脂滴。表明腎臟的固有細胞均參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。高三酰甘油血癥造成的腎損害為非免疫復(fù)合物介導(dǎo)，故電鏡下未見到電子致密物。

當(dāng)然，腎臟固有細胞攝取富含三酰甘油的脂質(zhì)后，轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，后者連同固有細胞本身可以分泌許多炎性反應(yīng)介質(zhì)，如生長因子、白介素等造成腎小球系膜細胞增殖、細胞外基質(zhì)積聚、腎小球硬化［10］。

綜上所述，高三酰甘油血癥可造成Wistar大鼠尿微量白蛋白水平增加、腎臟脂質(zhì)積聚、腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化，因此高三酰甘油血癥同樣具有腎毒性，需要積極干預(yù)。

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