PDZ結(jié)構(gòu)域中間序列結(jié)合特性及其臨床應(yīng)用

牟 一，蔡鵬飛，高友鶴

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系國家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，北京100005;2.病原生物學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)實(shí)驗室，北京 100730)

生命體中蛋白質(zhì)相互作用主要是由結(jié)構(gòu)域來介導(dǎo)。常見結(jié)構(gòu)域(PDZ，SH3，SH2，WW等)的常規(guī)結(jié)合特性已經(jīng)較為清楚，如SH2結(jié)構(gòu)域和PTB識別磷酸化的酪氨酸序列，SH3結(jié)構(gòu)域識別多個脯氨酸序列，WW結(jié)構(gòu)域識別PPXY模體，PDZ識別其配體的C末端序列等。近來研究發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)域也可以非常規(guī)結(jié)合配體蛋白，它們的非常規(guī)結(jié)合特性被逐漸挖掘，其中PDZ結(jié)構(gòu)域的非常規(guī)結(jié)合特性就很有代表性，比如，PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的中間序列(internal sequence)，形成PDZ-PDZ聚合體以及與脂類相互作用等［1－2］。我們主要對PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列這一非常規(guī)結(jié)合特性及以此為靶點(diǎn)所研發(fā)的復(fù)合物在臨床上的應(yīng)用作一簡要綜述。

1 PDZ結(jié)構(gòu)域及常規(guī)結(jié)合特性概述

PDZ結(jié)構(gòu)域是一類保守的參與蛋白質(zhì)相互作用的重要結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于從細(xì)菌、酵母、果蠅到高等動植物、后生動物的多種蛋白中，參與諸如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移與入侵、細(xì)胞極性、細(xì)胞增殖與凋亡、免疫細(xì)胞識別等一系列生命活動［3］。PDZ結(jié)構(gòu)域一般由70～90個氨基酸殘基組成，在結(jié)構(gòu)上形成5～6個β折疊和2～3個α螺旋，配體蛋白的C末端以反向的β折疊插入到β2和α2形成的疏水性溝槽中［2］。通常，PDZ結(jié)構(gòu)域特異性地識別和結(jié)合配體C末端的4～5個氨基酸殘基，傳統(tǒng)上分成4種結(jié)合規(guī)律:Ⅰ，－［S/T］－X－Φ*;Ⅱ，－Φ －X－Φ*;Ⅲ，－［D/E/K/R］－X－Φ*;Ⅳ －X－ψ －［D/E］* (X:任意氨基酸，Φ:疏水性氨基酸，ψ:芳香族氨基酸，*:終止密碼子)。

2 PDZ結(jié)構(gòu)域中間序列結(jié)合特性

除了常規(guī)結(jié)合配體蛋白的C末端，越來越多的研究支持PDZ結(jié)構(gòu)域也能夠結(jié)合配體蛋白的中間序列，本綜述對其中較明確的實(shí)例進(jìn)行了總結(jié)歸納(表1)。PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的中間序列的方式主要有兩類:1)結(jié)合配體的一級線性結(jié)構(gòu);2)通過結(jié)合中間序列形成同源或異源二聚體，甚至形成多聚體，形成“節(jié)點(diǎn)”豐富蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

表1 PDZ結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合的中間序列Table 1 PDZ domains that bind internal sequences

2.1 結(jié)合線性的一級結(jié)構(gòu)

PDZ結(jié)構(gòu)域可以通過結(jié)合線性的中間序列與配體蛋白作用。研究者運(yùn)用不同的研究方法在不同物種中發(fā)現(xiàn)了PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列的實(shí)例。例如，用核磁共振法(nuclear magnetic resonance，NMR)證實(shí)小鼠蓬亂蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)Dvl-PDZ可以與膜受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)rz)靠近C末端的保守模體(KTXXXW)結(jié)合［8］，還與Idax蛋白的保守模體(KTXXXI)結(jié)合［10］。用酵母雙雜交技術(shù)研究線蟲全基因組水平的PDZ結(jié)構(gòu)域的相互作用，發(fā)現(xiàn)超過50%的PDZ結(jié)構(gòu)域與配體的作用并不以常規(guī)的C-末端結(jié)合介導(dǎo)，表明線蟲的某些PDZ結(jié)構(gòu)域更傾向于結(jié)合中間序列［15］。人的nNOS-PDZ結(jié)構(gòu)域可以識別Vac-14的C末端，也能結(jié)合靠近C末端的一段中間序列，通過點(diǎn)突變確定其作用模體為-G-［D/E］-X-Φ-［D/E］-，類似常規(guī)的Ⅲ類配體;進(jìn)一步研究證實(shí)，該蛋白質(zhì)以結(jié)合中間序列為主，與C末端序列的結(jié)合只起輔助作用［6］。

PDZ結(jié)構(gòu)域之所以能結(jié)合中間序列主要是因為βB和αB之間的C-末端結(jié)合環(huán)(Carboxylate-binding loop)具有一定的柔韌性。例如，果蠅細(xì)胞極性蛋白Par-6-PDZ結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合鳥苷酸激酶蛋白Pals1的N末端線性序列HREMAV0D+1CP，其中的“HREMAV”模擬了常規(guī)結(jié)合的 C末端序列XEXLV/I-COOH。而Par-6-PDZ結(jié)構(gòu)域的C末端結(jié)合環(huán)中第1位是脯氨酸，即PLGF而不是常規(guī)的GLGF，在與配體Pals-1的中間序列相互作用后發(fā)生變形，從而減輕空間位阻。另外，+1位帶負(fù)電的殘基D與C-末端結(jié)合環(huán)上的帶正電的殘基K之間形成鹽鍵對兩者的結(jié)合起重要作用［7］。類似地，hScrib-PDZ4、ZO-1-PDZ1、RIMS2-PDZ結(jié)構(gòu)域中的C末端結(jié)合環(huán)中的GLGF模體被4個殘基隔開或者發(fā)生了點(diǎn)突變，形成了更大更柔性的環(huán)，使得能與中間序列結(jié)合［16］。

2.2 PDZ-PDZ的二聚體

研究發(fā)現(xiàn)，PDZ結(jié)構(gòu)域之間可以通過中間序列介導(dǎo)形成二聚體。經(jīng)典的模型是神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的PDZ 結(jié)構(gòu)域可以分別與突觸后密度蛋白(PSD-95)和肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白(syntrophin，Syn)的PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用形成二聚體。利用晶體衍射研究nNOS-Syn相互作用，發(fā)現(xiàn)兩者之間以“頭對尾”的方式結(jié)合，其中“頭”是指Syn的PDZ結(jié)構(gòu)域的疏水口袋，“尾”是指與之結(jié)合的 nNOS的 β 發(fā)夾模體［4］;即 nNOS-PDZ靠近N末端處βG-βH之間形成的尖銳的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并模擬常規(guī)配體C末端序列的構(gòu)象，與Syn的PDZ結(jié)構(gòu)域疏水口袋對接(圖1)，這種通過結(jié)合中間序列的方式是PDZ結(jié)構(gòu)域異源二聚化的另一模型(也可通過二硫鍵形成PDZ二聚體)，體現(xiàn)了蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。更重要的是，僅僅靠β發(fā)夾結(jié)構(gòu)與疏水口袋的結(jié)合并不能形成穩(wěn)定的復(fù)合物，還需要nNOS-PDZ結(jié)構(gòu)域中殘基Asp62與其β發(fā)夾結(jié)構(gòu)中殘基Arg121之間形成鹽鍵穩(wěn)定β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，破環(huán)這一分子內(nèi)部的鹽鍵將阻斷nNOS與PSD-95或Syn的相互作用。另外，nNOS與PSD-95 PDZ2結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體后，其β發(fā)夾上的殘基Leu107-Phe111變得更加剛性，對穩(wěn)定復(fù)合物起到重要作用［5，17］。

圖1 nNOS-Syn的PDZ結(jié)構(gòu)域形成的“頭對尾”異源二聚體Fig 1 Head-to-tail heterodimer of nNOS-Syn PDZ domains

膜牽引蛋白GRASP55和GRASP65是高爾基體膜網(wǎng)絡(luò)的形成兩個關(guān)鍵蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物高爾基體膜牽引蛋白GRASP55中的GRASP結(jié)構(gòu)域是由兩個串聯(lián)的不規(guī)則的PDZ結(jié)構(gòu)域組成，PDZ2結(jié)構(gòu)域中的中間序列(196YGYL199)在分子表面形成尖銳的突出(而非β片層)，與另一GRASP55分子的PDZ1結(jié)構(gòu)域深口袋狀凹槽結(jié)合，介導(dǎo)形成同型牽引復(fù)合物，這一作用模型區(qū)別于nNOS與PSD-95或Syn之間的相互作用，是一種新的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列的模式［13］。

3 臨床應(yīng)用

從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度講，蛋白質(zhì)之間一般只有形成相互作用網(wǎng)絡(luò)才能發(fā)揮功能，富含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白往往是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的“節(jié)點(diǎn)”，其特異性的關(guān)鍵作用使其成為下一代藥物的理想靶標(biāo)［18－19］，針對 PDZ 結(jié)構(gòu)域設(shè)計的小分子抑制劑(如:多肽、化合物等)，可特異性阻斷其與特定配體之間的相互作用，為相關(guān)疾病的治療提供新途徑［20］?；赑DZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列的特性研發(fā)的小分子藥物或多肽抑制劑已在癌癥、中風(fēng)和抗病毒感染等疾病的治療上顯示出了良好的潛力。

Wnt信號通路在腫瘤發(fā)生，胚胎發(fā)育，二相軸分化方面起了重要作用，Dvl蛋白介導(dǎo)Wnt信號通路從受體向下游效應(yīng)分子傳遞［21］。小鼠Dvl-PDZ結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合Wnt受體Frz接近C末端的中間序列，突變此保守模體即抑制經(jīng)典的 Wnt信號通路［8］，由此提示針對Dvl-PDZ結(jié)構(gòu)域設(shè)計小分子藥物抑制劑具有阻斷癌細(xì)胞的Wnt信號通路的潛力。在此基礎(chǔ)上，研究人員從噬菌體文庫中篩選到與人Dvl2-PDZ結(jié)構(gòu)域親和力最強(qiáng)的多肽pep-N3(EIVLWSDIP)，將其設(shè)計成藥物多肽來阻斷 Wnt/β-catenin信號，該藥物多肽具有特異性高，毒性較低的特點(diǎn)，相對于小分子化合物FJ9，不易引起細(xì)胞死亡，具有良好的抗腫瘤治療的潛力［14］。借助于電腦虛擬篩選和NMR波普法，研究者從類藥化合物庫中篩選到能與mDvl1-PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合且具有良好細(xì)胞膜參透性的小分子抑制劑3289-8625，能夠阻斷Wnt信號通路，并能有效抑制前列腺癌細(xì)胞PC3的生長，該化合物的鑒定為新型抗腫瘤藥物的設(shè)計提供了新的模板［22］。另外，針對Dvl-PDZ結(jié)構(gòu)域拮抗劑的藥效基團(tuán)模型展開配體相似性搜索，可篩選到以更高親和力與Dvl-PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物，由此提供更多能有效抑制Wnt信號通路的候選分子［23］。

有研究表明，N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)和 nNOS 的過度活化是腦卒中后神經(jīng)元細(xì)胞死亡的主要原因，直接阻斷NMDARs和nNOS能改善神經(jīng)元的損傷，但有嚴(yán)重的副作用。由腦卒中引起的局部缺血將促進(jìn)nNOS與PSD95之間的相互作用，而通過過表達(dá)nNOS-N1-133則能阻斷此相互作用，并有效預(yù)防大腦缺血性損傷［17］?；趎NOS-PSD-95之間相互作用的特性，研究人員設(shè)計了一系列小分子復(fù)合物，從中篩選到一種有效且能避免副作用的小分子藥物ZL006。這種藥物不僅對大腦缺血有較好的保護(hù)作用，而且可以避免直接干預(yù)NMDAR或nNOS引起的不良反應(yīng)，如空間記憶障礙、行為異常等，為腦卒中提供了新的治療途徑［17］。

此外，nNOS與PSD95之間的相互作用也是治療痛覺過敏的潛在靶點(diǎn)，F(xiàn)lorio等研究發(fā)現(xiàn)利用小分子抑制劑IC87201和細(xì)胞膜可穿透性融合蛋白tat-nNOS(AA1-299)能夠特異性阻斷 nNOS與PSD95之間的結(jié)合，抑制原代海馬神經(jīng)元NMDA-nNOS信號通路，但并不影響nNOS的催化活性;進(jìn)一步在嚙齒類動物模型中的實(shí)驗表明，上述抑制劑均能有效逆轉(zhuǎn)急性熱痛敏和慢性機(jī)械性痛敏，為痛覺過敏的治療提供了新途徑［24］。

PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列可介導(dǎo)病毒與宿主的相互作用。例如，登革病毒(Dengue virus，DENV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS5的中間序列與緊密聯(lián)接蛋白ZO1-PDZ1結(jié)合，影響宿主細(xì)胞增殖并抑制IFN信號通路［16］。類似地，蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)NS5蛋白的甲基化轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域可以通過中間序列與人的hScrib-PDZ4結(jié)構(gòu)域作用，從而阻止STAT1的磷酸化，削弱由Ⅰ類和Ⅱ類干擾素介導(dǎo)的 JAK-STAT信號通路［11］。因此，以PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列的特性為切入點(diǎn)，可以設(shè)計特異性好，且副作用小的小分子化合物或多肽藥物，用于抗病毒感染的治療。

4 問題與展望

目前，發(fā)現(xiàn)很多PDZ結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合中間序列，具有一定的普遍性和多樣性。PDZ結(jié)構(gòu)域中間序列的結(jié)合規(guī)律還沒有像C末端結(jié)合規(guī)律那么詳盡，還有待于進(jìn)一步系統(tǒng)研究。這一領(lǐng)域的深入了解，將是對常規(guī)結(jié)合特性的補(bǔ)充和擴(kuò)展，是發(fā)現(xiàn)新型配體蛋白，豐富蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的有效途徑之一，有利于發(fā)現(xiàn)更多潛在的生命活動機(jī)制?；赑DZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合中間序列的特性研發(fā)小分子藥物或多肽抑制劑在若干疾病模型中顯示出強(qiáng)勁的治療潛力，但有待于進(jìn)一步的優(yōu)化及臨床前研究。相信隨著研究的深入，會有更多以此為靶點(diǎn)的新型藥物得以研發(fā)和篩選，用于相關(guān)疾病的臨床治療。

［1］Gallardo R，Ivarsson Y，Schymkowitz J，et al.Structural diversity of PDZ-lipid interactions［J］.Chembiochem，2010，11:456－467.

［2］Lee HJ，Zheng JJ.PDZ domains and their binding partners:structure，specificity，and modification ［J］.Cell Commun Signal，2010，8:8.doi:10.1186/1478-811X-8-8.

［3］Javier RT，Rice AP.Emerging theme:cellular PDZ proteins as common targets of pathogenic viruses［J］.J Virol，2011，85:11544－11556.

［4］Hillier BJ，Christopherson KS，Prehoda KE，et al.Unexpected modes of PDZ domain scaffolding revealed by structure of nNOS-syntrophin complex ［J］.Science，1999，284:812－815.

［5］Tochio H，Mok YK，Zhang Q，et al.Formation of nNOS/PSD-95 PDZ dimer requires a preformed beta-finger structure from the nNOS PDZ domain ［J］.J Mol Biol，2000，303:359－370.

［6］Lemaire JF，McPherson PS.Binding of Vac14 to neuronal nitric oxide synthase:Characterisation of a new internal PDZ-recognition motif［J］.FEBS Lett，2006，580:6948 －6954.

［7］Penkert RR，DiVittorio HM，Prehoda KE.Internal recognition through PDZ domain plasticity in the Par-6-Pals1 complex［J］.Nat Struct Mol Biol，2004，11:1122 －1127.

［8］Wong HC，Bourdelas A，Krauss A，et al.Direct binding of the PDZ domain of Dishevelled to a conserved internal sequence in the C-terminal region of Frizzled ［J］.Mol Cell，2003，12:1251－1260.

［9］Punchihewa C，F(xiàn)erreira AM，Cassell R，et al.Sequence requirement and subtype specificity in the high-affinity interaction between human frizzled and dishevelled proteins［J］.Protein Sci，2009，18:994 －1002.

［10］London TB，Lee HJ，Shao Y，et al.Interaction between the internal motif KTXXXI of Idax and mDvl PDZ domain［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，322:326 －332.

［11］Werme K，Wigerius M，Johansson M.Tick-borne encephalitis virus NS5 associates with membrane protein scribble and impairs interferon-stimulated JAK-STAT signalling［J］.Cell Microbiol，2008，10:696 －712.

［12］Slattery C，Jenkin KA，Lee A，et al.Na+-H+exchanger regulatory factor 1(NHERF1)PDZ scaffold binds an internal binding site in the scavenger receptor megalin［J］.Cell Physiol Biochem，2011，27:171－178.

［13］Truschel ST，Sengupta D，F(xiàn)oote A，et al.Structure of the membrane-tethering GRASP domain reveals a unique PDZ ligand interaction that mediates Golgi biogenesis［J］.J Biol Chem，2011，286:20125－20129.

［14］Zhang Y，Appleton BA，Wiesmann C，et al.Inhibition of Wnt signaling by Dishevelled PDZ peptides［J］.Nat Chem Biol，2009，5:217 －219.

［15］Lenfant N，Polanowska J，Bamps S，et al.A genome-wide study of PDZ-domain interactions in C.elegans reveals a high frequency of non-canonical binding［J］.BMC Genomics，2010，11:671.doi:10.1186/1471-2164-11-671.

［16］Ellencrona K，Syed A，Johansson M.Flavivirus NS5 associates with host-cell proteins zonula occludens-1(ZO-1)and regulating synaptic membrane exocytosis-2(RIMS2)via an internal PDZ binding mechanism［J］.Biol Chem，2009，390:319－323.

［17］Zhou L，Li F，Xu HB，et al.Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS with PSD-95［J］.Nat Med，2010，16:1439－1443.

［18］Hormozdiari F，Salari R，Bafna V，et al.Protein-protein interaction network evaluation for identifying potential drug targets［J］.J Comput Biol，2010，17:669 －684.

［19］Houslay MD.Disrupting specific PDZ domain-mediated interactions for therapeutic benefit［J］.Br J Pharmacol，2009，158:483－485.

［20］Dev KK.Making protein interactions druggable:targeting PDZ domains ［J］.Nat Rev Drug Discov，2004，3:1047－1056.

［21］Gao C，Chen YG.Dishevelled:The hub of Wnt signaling［J］.Cell Signal，2010，22:717 －727.

［22］Grandy D，Shan J，Zhang X，et al.Discovery and characterization of a small molecule inhibitor of the PDZ domain of dishevelled［J］.J Biol Chem，2009，284:16256－16263.

［23］Shan J，Zhang X，Bao J，et al.Synthesis of Potent Dishevelled PDZ Domain InhibitorsGuided byVirtual Screening and NMR Studies［J］.Chem Biol Drug Des，2012，79:376 －383.

［24］Florio SK，Loh C，Huang SM，et al.Disruption of nNOSPSD95 protein-protein interaction inhibits acute thermal hyperalgesia and chronic mechanical allodynia in rodents［J］.Br J Pharmacol，2009，158:494－506.