去甲斑蝥素抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究

孫 巖 李 瑛 孫 林 劉 健 凌光輝 劉映紅 周 循 劉伏友

去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的重要衍生物，是一種特異性蛋白磷酸酶抑制劑，具有抗腫瘤活性、炎癥免疫調(diào)節(jié)作用、防治器官組織纖維化、抗氧化作用和升高白細(xì)胞作用[1]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，NCTD能減輕蛋白超負(fù)荷腎病大鼠[2]和糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化[3]，NCTD還可抑制白蛋白體外刺激的腎小管上皮細(xì)胞的增生和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)[4]，所以，我們認(rèn)為NCTD是一種具有前景的抗腎間質(zhì)纖維化藥物，但具體機(jī)制尚不清楚。

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的共同途徑。腎間質(zhì)纖維化的過程包括腎小管萎縮、肌成纖維細(xì)胞堆積和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的沉積。表達(dá)α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞是ECM的主要來源，是腎間質(zhì)纖維化的決定性效應(yīng)細(xì)胞。上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的重要通路，是腎間質(zhì)纖維化發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制和中心環(huán)節(jié)[5-7]。

前期研究顯示，NCTD可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT，抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/3的信號通路及抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail1[8，9]。鑒于NCTD對腎小管間質(zhì)的保護(hù)作用，我們推測，NCTD改善腎間質(zhì)纖維化的效應(yīng)可能與抑制或逆轉(zhuǎn)EMT有關(guān)。為此，本研究擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型，觀察NCTD對腎小管EMT的影響。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。

主要試劑 NCTD(利佳，北京雙鶴高科天然藥物公司，國藥準(zhǔn)字H11022100)；兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(Abcam)，兔抗大鼠E鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(Santa Cruz)、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz)、小鼠抗大鼠β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz)；組織細(xì)胞蛋白裂解液、DEPC、PMSF(北京鼎國生物公司)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)；PCR引物(上海生工及英俊生物技術(shù)公司合成)；Trizol、2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，ECL顯影劑、PVDF膜(Millipore)。

實(shí)驗(yàn)方法

動物分組 健康雄性SD大鼠(二級)，體重200～220g，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)和NCTD治療組(NCTD組)，每組6只。UUO組于左側(cè)腎臟近腎門處結(jié)扎輸尿管，再于輸尿管遠(yuǎn)離腎門處二次結(jié)扎[10]。Sham組只游離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎后關(guān)閉腹腔。NCTD組術(shù)后當(dāng)天予NCTD 0.1 mg/(kg·d)[2,3]用無菌生理鹽水稀釋后腹腔注射，Sham組和UUO組予相應(yīng)體積無菌生理鹽水腹腔注射，觀察至術(shù)后2周。

標(biāo)本采集 尿液與血液：實(shí)驗(yàn)2周收集24h尿液并測尿量，離心后-20℃保存，待測尿蛋白。處死大鼠前腹主動脈取血離心，-20℃保存，待測血清肌酐(SCr)。

腎組織：氯胺酮(2 ml)、地西泮(2 ml)和阿托品(1 ml)各一支按1∶1∶1混合用生理鹽水稀釋成10 ml，0.75 ml/100g體重腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血后插管注入4℃預(yù)冷的肝素生理鹽水至整個左側(cè)腎臟顏色變蒼白后，小心游離切斷腎蒂，腎臟置于冰上，快速去除包膜，將其橫切成3 mm厚的組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定用于制作石蠟切片；其余的一半裝入凍存管保存于液氮，用于提取總RNA；另一半裝入另一凍存管保存于-70℃冰箱，用于提取組織蛋白。分別送免疫組化、Western Blot、RT-PCR進(jìn)行相關(guān)檢測。

指標(biāo)檢測

尿蛋白定量和SCr 24h尿蛋白定量采用全自動生化分析儀檢測，SCr采用日立7170A全自動生化分析儀檢測。

腎組織免疫組化 腎組織經(jīng)固定、常規(guī)脫水、包埋、4 μm厚切片供免疫組化。免疫組化染色過程：0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中熱修復(fù)抗原，冷卻后滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育20 min，滴加兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(1∶50,abcom)，兔抗大鼠E-cadherin多克隆抗體(1∶50,Santa Cruz)、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶25,Santa Cruz)，4℃孵育過夜；滴加HRP標(biāo)記的二抗IgG(37℃孵育30 min)；以上每一步驟之后均用PBS液充分漂洗3次，每次5 min。繼之按DAB試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，顯微鏡下掌握顯色程度，適時蒸溜水終止。蘇木素輕度復(fù)染，流水沖洗。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片、光鏡觀察。陰性Sham組用PBS代替上述一抗進(jìn)行反應(yīng)。圖像半定量分析：顯微鏡觀察，每組隨機(jī)觀察10個視野，Image-ProPlus 6.0 分析各視野下平均光密度值(AOD)，AOD為陽性目標(biāo)光密度和陽性面積百分比(IOD/Area)，代表待測抗原量。

Western Blot檢測腎臟組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β1蛋白表達(dá) 取腎臟組織約60 mg，液氮冷凍并碾碎后加入200 μl預(yù)冷的組織蛋白裂解液(加入1∶100的PMSF)，用玻璃勻漿器冰上勻漿，直至充分裂解。離心(4℃，12 000 r/min，15 min)，將所得上清移入另一支1.5 ml EP管，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。按照蛋白質(zhì)濃度取20 μg總蛋白并加入5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液，100℃變性10 min，變性樣品點(diǎn)離后上樣跑8%～12% SDS-PAGE膠。恒壓下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜，分別加入相應(yīng)倍稀釋的α-SMA(1∶4 000)、E-cadherin(1∶3 000)、TGF-β1(1∶3 000)一抗和β-actin(1∶2 000)單克隆抗體，孵育1h或4℃過夜。PBS-T洗膜3次，加入對應(yīng)的1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記IgG，孵育1～2h。PBS-T洗膜3次，分別取ECL試劑盒Sol.A：0.5 ml，Sol.B：0.5 ml，混合后加于PVDF膜，反應(yīng)5～10 min，將PVDF膜固定在Kodak暗箱，Kodak IS4000凝膠成像分析系統(tǒng)曝光掃描并且分析結(jié)果，以所測得的各指標(biāo)的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

RT-PCR方法檢測腎臟組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β1 mRNA表達(dá) 采用Trizol RNA提取法提取腎組織總RNA，取總RNA 2.5 μg按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)說明書步驟進(jìn)行cDNA合成?；蛐蛄袕腉enebank中查閱，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)。引物序列分別為(引物分別由上海生工生物技術(shù)有限公司合成)：Rat α-SMA 280 bp(上游：5’-TCCTGACCCTGAAGTATCCG-3’，下游：5’-TCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3’)，Rat E-cadherin 550bp(上游：5’-GTCAAACGGCATCTAAAGC-3’，下游：5’-CAAAGACCTCCTGGATAAACT-3’)，Rat TGF-β138 bp(上游：5’-CCGCAACAACGCAATC-3’，下游：5’-ATGAGGAGCAGGAAGGGT-3’)，Rat β-actin 188 bp(上游：5’-GGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游： 5’-ACCCAGGAAGGAAGGCT-3’)。PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增α-SMA mRNA的反應(yīng)程序 95℃、5 min預(yù)變性，94℃，45s變性→56℃、45s退火→72℃、45s延伸，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min 4℃終止；擴(kuò)增E-cadherin mRNA的反應(yīng)程序 95℃、3 min預(yù)變性，94℃，30s變性→52℃、30s退火→72℃、30s延伸，共34個循環(huán)，72℃延伸10 min 4℃終止；擴(kuò)增TGF-β1 mRNA的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃、5 min預(yù)變性，94℃，30s變性→55℃、30s退火→72℃、30s延伸，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min4℃終止；擴(kuò)增β-actin mRNA的反應(yīng)程序 95℃、5 min預(yù)變性，94℃，30s變性→58℃、30s退火→72℃、30s延伸，共25個循環(huán)，72℃延伸7 min 4℃終止。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，分別取擴(kuò)增產(chǎn)物各8 μl，用2%的瓊脂糖凝膠在100伏特的電壓下電泳40 min,用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖片。最后用凝膠圖像分析軟件系統(tǒng)分析圖片吸光度，獲得相應(yīng)的吸光值，以所獲得的各指標(biāo)的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表半定量值。

結(jié) 果

NCTD對蛋白尿與SCr水平的影響UUO術(shù)后2周，各組間蛋白尿水平無明顯變化。與Sham組比較，UUO組SCr水平升高(P<0.05)；與UUO組比較，NCTD組SCr水平下降(P<0.05，表1)。

表1 NCTD對UUO 大鼠蛋白尿和SCr的影響

NCTD對UUO大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin與TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果 免疫組化圖像平均光密度(AOD= IOD/Area)分析顯示：Sham組大鼠腎組織，腎小管和間質(zhì)未見α-SMA表達(dá)，而E-cadherin表達(dá)顯著，主要分布于腎小管，TGF-β1表達(dá)主要分布于腎小管間質(zhì)；UUO組腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)α-SMA表達(dá)顯著增強(qiáng)，E-cadherin表達(dá)明顯減弱，腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及浸潤的炎癥細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與UUO組比較，NCTD組腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)α-SMA表達(dá)明顯減輕，腎小管細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯增強(qiáng)，腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)明顯減輕(P<0.05，圖1、表2)。

圖1 NCTD調(diào)節(jié)UUO大鼠腎臟組織α-SMA,E-cadherin和TGF-β1的表達(dá)(IP，×200)

表2 NCTD調(diào)節(jié)UUO大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin和TGF-β1的表達(dá)

Western Blot結(jié)果 Sham組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達(dá)較弱，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯，有一定量TGF-β1蛋白的表達(dá)；與Sham組比較，UUO組腎組織α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，TGF-β1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖2)；與UUO組比較，NCTD組腎組織α-SMA表達(dá)明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05，圖2)。

NCTD對UUO大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin與TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示：Sham組大鼠腎組織α-SMA mRNA表達(dá)較弱，E-cadherin mRNA表達(dá)顯著，有一定量TGF-β1 mRNA的表達(dá)；與Sham組比較，UUO組腎組織α-SMA和TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，E-cadherin mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05，圖3)；與UUO組相比，NCTD組腎組織α-SMA和TGFβ1 mRNA表達(dá)下調(diào)，E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05，圖3)。

討 論

無論原發(fā)性腎臟病性質(zhì)如何，腎小管間質(zhì)纖維化的組織學(xué)改變與慢性腎功能喪失緊密相關(guān)[7，11]。目前，腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制尚不明確，在腎纖維化過程中，一些EMT的標(biāo)志物在腎小管間質(zhì)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)在TGF-β1和其他炎癥因子誘導(dǎo)下，近端腎小管上皮細(xì)胞能夠經(jīng)歷EMT，腎纖維化動物模型提示36%肌成纖維細(xì)胞來源于經(jīng)歷EMT的腎小管上皮細(xì)胞[12 ]，而且人類慢性腎臟病腎活檢組織的結(jié)果提示與腎間質(zhì)纖維化和SCr水平相關(guān)的腎小管細(xì)胞具有EMT的表型特征[13]，支持體內(nèi)EMT發(fā)生的推論，提示腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展過程中EMT具有重要作用。

圖2 NCTD調(diào)節(jié)UUO大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin與TGF-β1蛋白的表達(dá)

圖3 NCTD調(diào)節(jié)UUO大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin與TGF-β1 mRNA的表達(dá)

EMT過程中上皮細(xì)胞喪失上皮表型、獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征。其中，E-cadherin是上皮細(xì)胞的主要基因，E-cadherin高表達(dá)能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)分化(MET)，是維持上皮表型的重要決定因素[14]。α-SMA是一種可收縮性蛋白，富集應(yīng)力纖維，α-SMA的生成是肌成纖維細(xì)胞收縮機(jī)制的關(guān)鍵。病理狀況下，α-SMA被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞最重要的標(biāo)志蛋白。在眾多調(diào)節(jié)EMT的生長因子、細(xì)胞因子和介質(zhì)中，TGF-β1是誘導(dǎo)體內(nèi)體外EMT的最重要細(xì)胞因子[15，16]。腎小管上皮細(xì)胞在TGF-β1刺激下E-cadherin表達(dá)喪失與α-SMA表達(dá)相關(guān)，提示間充質(zhì)程序基因開啟，而上皮程序基因關(guān)閉[17-21]。

UUO模型是研究非免疫性腎間質(zhì)損傷的成熟動物模型，可反映人類梗阻性腎病和腎間質(zhì)纖維化病變的過程[22]。Bascands等[23]UUO術(shù)后1d，梗阻側(cè)TGF-β1及其Ⅰ型受體(TβR-Ⅰ)迅速增加，特異性分布于梗阻側(cè)腎小管上皮細(xì)胞，且梗阻側(cè)腎小管上皮細(xì)胞表型改變明顯，E-cadherin喪失、α-SMA的重新表達(dá)，隨時間的變化呈負(fù)向關(guān)系。UUO大鼠模型術(shù)后3d，梗阻側(cè)腎臟即可出現(xiàn)早期腎間質(zhì)纖維化損傷，間質(zhì)區(qū)增寬，腎小管間質(zhì)散在炎癥細(xì)胞，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原沉積增加，Ⅳ型膠原α1mRNA明顯升高，因此，認(rèn)為導(dǎo)致纖維化的事件在梗阻開始就即刻得以啟動[24]。Nagle和Bulger[25]在UUO兔梗阻側(cè)腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)升高，而腎小球變化不明顯。董飛俠等[26]也發(fā)現(xiàn)UUO術(shù)后隨時間的推移，α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞增多。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UUO大鼠術(shù)后2周，與Sham組比較，梗阻側(cè)腎臟腎小管間質(zhì)α-SMA表達(dá)明顯增加、E-cadherin表達(dá)下降，TGF-β1表達(dá)增加。梗阻側(cè)腎組織α-SMA、E-cadherin和TGF-β1mRNA水平和蛋白定量水平的檢測結(jié)果亦顯示相似特點(diǎn)，提示UUO大鼠模型梗阻側(cè)腎臟腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)歷EMT表型過程，而且TGF-β1表達(dá)上調(diào)。

斑蝥素是源自中國大斑蝥(Mylabris phalerata or M.cichorii)和Spanish fly的干體，為劇毒中藥材，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶1(PP1)和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)的抑制劑，具有抗癌活性、抗病毒、升高白細(xì)胞等多種生物活性。NCTD是斑蝥素去掉2、3位兩個甲基的衍生物，腎毒性明顯減弱。我們的研究已發(fā)現(xiàn)，NCTD能減輕蛋白超負(fù)荷腎病大鼠[3]和糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化[4]。體外實(shí)驗(yàn)顯示，NCTD可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT，其抑制腎小管EMT的作用可能與下調(diào)TGF-β1介導(dǎo)的Smad2、Smad3信號蛋白及轉(zhuǎn)錄分子Snail1的表達(dá)有關(guān)[8，9]。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們擬利用UUO模型觀察NCTD抗腎間質(zhì)纖維化作用是否與其抑制EMT表型有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)觀察的初步結(jié)果顯示，UUO大鼠模型梗阻側(cè)腎臟腎小管間質(zhì)α-SMA表達(dá)上調(diào)，而E-cadherin表達(dá)下調(diào)，TGF-β1表達(dá)上調(diào)，提示UUO術(shù)后2周梗阻側(cè)腎臟發(fā)生腎小管EMT表型的變化，而且TGF-β1表達(dá)上調(diào)。而NCTD干預(yù)組SCr降低，梗阻側(cè)腎臟α-SMA表達(dá)下調(diào)、E-cadherin表達(dá)上調(diào)，TGF-β1表達(dá)下調(diào)，表明NCTD能夠抑制腎小管EMT的表型和下調(diào)TGF-β1高表達(dá)。由此推測NCTD可能通過抑制TGF-β1的高表達(dá)，從而延緩或阻止TGF-β1介導(dǎo)的EMT，進(jìn)而阻斷腎間質(zhì)纖維化。

最近Humphreys等[27]研究結(jié)果顯示，UUO小鼠腎損傷10～14d后未發(fā)現(xiàn)RFP+標(biāo)記的腎小管上皮細(xì)胞共表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白，而肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在UUO腎損傷后10d α-SMA和S100A4表達(dá)陽性的腎間質(zhì)細(xì)胞，與Iwano等[12]的結(jié)論不一致，據(jù)此，我們?nèi)孕枰诖顺醪窖芯炕A(chǔ)進(jìn)一步深入觀察和論證NCTD抗腎間質(zhì)纖維化作用和EMT的關(guān)系。

小結(jié)：本研究結(jié)果顯示NCTD具有抑制腎小管EMT的作用，該作用可能與下調(diào)UUO大鼠梗阻側(cè)腎臟腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1高表達(dá)有關(guān)，但腎小管EMT機(jī)制的研究尚需進(jìn)一步論證。

1 Fan YZ,Fu JY,Zhao ZM,et al.Inhibitory effect of norcantharidin on the growth of human gallbladder carcinoma GBC-SD cells in vitro.Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2007,6(1):72-80.

2 Liu FY,Li Y,Peng YM,et al.Norcantharidin ameliorates proteinuria,associated tubulointerstitial inflammation and fibrosis in protein overload nephropathy.Am J Nephrol,2008,28(3):465-477.

3 Li Y,Chen Q,Liu FY,et al.Norcantharidin attenuates tubulointerstitial fibrosis in rat models with diabetic nephropathy.Ren Fail,2011,33(2):233-241.

4 Li Y,Liu FY,Peng YM,et al.Norcantharidin inhibits proliferation and fibronectin expression of HK-2 cells induced by albumin in vitro.Cell Biol Int,2011 Jun 15.[Epub ahead of print]

5 Eyden B.The myofibroblast:phenotypic characterization as a prerequisite to understanding its functions in translational medicine.J Cell Mol Med,2008,12(1):22-37

6 Sato M,Muragaki Y,Saika S,et al.Targeted disruption of TGF-beta1/Smad3 signaling protects against renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction.J Clin Invest,2003,112(10):1486-1494.

7 Bani-Hani AH,Campbell MT,Meldrum DR,et al.Cytokines in epithelial-mesenchymal transition:a new insight into obstructive nephropathy.J Urol,2008,180(2):461-468.

8 劉伏友,孫 巖,孫 林,等.去甲斑蝥素對TGF-β1誘導(dǎo)的人近端腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化以及轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達(dá)的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2009,10(11):952-957.

9 孫 巖,劉伏友,孫 林,等.去甲斑蝥素對TGF-β1誘導(dǎo)的人近端腎小管細(xì)胞上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化以及信號蛋白Smad2/3表達(dá)的影響.中南藥學(xué),2010,8(3):170-174.

10 Zhang D,Sun L,Xian W,et al.Low-dose paclitaxel ameliorates renal fibrosis in rat UUO model by inhibition of TGF-beta/Smad activity.Lab Invest,2010,90(3):436-447.

11 Nangaku M.Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney:final common pathways to end-stage renal failure.Intern Med,2004,43(1):9-17.

12 Iwano M,Plieth D,Danoff TM,et al.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis.J Clin Invest,2002,110(3):341-350.

13 Rastaldi MP,Ferrario F,Giardino L,et al.Epithelial-mesenchymal transition of tubular epithelial cells in human renal biopsies.Kidney Int,2002,62 (1):137-146.

14 Thuault S,Tan EJ,Peinado H,et al.HMGA2 and Smads co-regulate SNAIL1 expression during induction of epithelial-to-mesenchymal transition.J Biol Chem,2008,283(48):33437-33446.

15 Yang J,Liu Y.Dissection of key events in tubular epithelial to myofibroblast transition and its implications in renal interstitial fibrosis.Am J Pathol,2001,159(4):1465-1475.

16 Aresu L,Rastaldi MP,Pregel P,et al.Dog as model for down-expression of E-cadherin and beta-catenin in tubular epithelial cells in renal fibrosis.Virchows Arch,2008,453(6):617-625.

17 Burns WC,Twigg SM,Forbes JM,et al.Connective tissue growth factor plays an important role in advanced glycation end product-induced tubular epithelial-to-mesenchymal transition:implications for diabetic renal disease.J Am Soc Nephrol,2006,17(9):2484-2494.

18 White LR,Blanchette JB,Ren L,et al.The characterization of alpha5-integrin expression on tubular epithelium during renal injury.Am J Physiol Renal Physiol,2007,292(2):F567-576.

19 Vyas-Read S,Shaul PW,Yuhanna IS,et al.Nitric oxide attenuates epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,293(1):L212-221.

20 Poncelet AC,Schnaper HW,Tan R,et al.Cell phenotype-specific down-regulation of Smad3 involves decreased gene activation as well as protein degradation.J Biol Chem,2007,282(21):15534-15540.

21 Masszi A,Fan L,Rosivall L,et al.Integrity of cell-cell contacts is a critical regulator of TGF-beta 1-induced epithelial-to-myofibroblast transition:role for beta-catenin.Am J Pathol,2004,165(6):1955-1967.

22 Klahr S,Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Pathol Renal Physiol,2002,283(5):F861-875.

23 Bascands JL,Schanstra JP.Obstructive nephropathy:insights from genetically engineered animals.Kidney Int,2005,68(3):925-937.

24 Ogata Y,Ishidoya S,Fukuzaki A,et al.Upregulated expression of transforming growth factor-beta,type IV collagen,and plasminogen activator inhibitor-1 mRNA are decreased after release of unilateral ureteral obstruction.Tohoku J Exp Med,2002,197(3):159-168.

25 Nagle RB,Bulger RE.Unilateral obstructive nephropathy in the rabbit.II.Late morphologic changes.Lab Invest,1978,38(3):270-278.

26 董飛俠,何立群,黃 迪等.單側(cè)輸尿管結(jié)扎再通大鼠模型的建立方法及其評價(jià).中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(3):30-34.

27 Humphreys BD,Lin SL,Kobayashi A,et al.Fate Tracing Reveals the Pericyte and Not Epithelial Origin of Myofibroblasts in Kidney Fibrosis.Am J Pathol,2010,176(1):85-97.