肌肉特異性糖皮質(zhì)激素受體基因敲除對慢性腎臟病骨骼肌消耗的影響

王會玲 丁婷婷 許 燁 張金元

骨骼肌消耗是慢性腎臟病(CKD)蛋白質(zhì)-能量消耗的重要特征，與尿毒癥時體內(nèi)毒素蓄積、代謝性酸中毒、胰島素抵抗、神經(jīng)內(nèi)分泌異常、微炎癥狀態(tài)等因素，引起骨骼肌蛋白質(zhì)分解代謝加劇有關(guān)[1，2]。研究提示CKD時機(jī)體調(diào)控蛋白質(zhì)分解的主要途徑——泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)激活，使肌肉特異性的E3連接酶：肌肉萎縮蛋白Fbox-1(muscle atrophy F-box,MAFbx,也稱作Atrogin-1)和肌環(huán)指蛋白1 (MuRF-1)表達(dá)升高，引起肌肉蛋白質(zhì)分解加速，與CKD骨骼肌消耗關(guān)系密切[3,4]。既往研究顯示，內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素(endogenous glucocorticoids，eGC)水平升高與CKD小鼠模型的骨骼肌消耗有關(guān)[5]，臨床血液透析患者的eGC水平可升高5倍，并與透析患者的營養(yǎng)不良和肌肉消耗密切相關(guān)。阻斷糖皮質(zhì)激素(GC)信號能否改善腎衰竭時的骨骼肌消耗，目前尚未見報道。本研究觀察肌肉特異性糖皮質(zhì)激素受體(GCR)基因敲除(MGRKO)小鼠，在CKD狀態(tài)下的骨骼肌消耗，并探討其作用機(jī)制。

材料與方法

材料與試劑MGRKO小鼠由美國Baylor醫(yī)學(xué)院腎臟病與內(nèi)分泌實驗室提供。采用loxP floxed GR-Cre體系制作MGRKO小鼠，以同源lox/lox小鼠為對照。OCT包埋劑 (Tissue-Tek，USA)；GC檢測試劑盒EIA kit (Cayman，500651)；總RNA提取試劑盒(TRIzol Reagent,invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptⅢ first Strand Synthesis System for PCR (invitrogen)；Real-time PCR試劑盒iQ SYBR Supermix (Bio-Rad)；組織裂解液(CellLytic TM MT，Sigma)；超速低溫離心機(jī)(Micromax RF)；冰凍切片機(jī)(Leica CM1850)；熒光定量PCR熱循環(huán)儀(美國ABI,Applied Biosystems 7500)；Image J v1.36 圖像處理軟件(NIH)。

采用5/6腎切除制作CKD小鼠模型小鼠均為8周齡，體重25.4～26.8g，正常、自由飲食。小鼠腹腔注射克他命麻醉后，無菌條件下切除左腎上、下兩極各約1/3皮質(zhì)，止血后將殘腎送入腹腔，依次縫合腹膜和皮膚，然后摘除右腎。假手術(shù)組(CTL組)依照同樣步驟給予麻醉和打開腹腔，暴露腎臟1 min后將腎臟送入腹腔，關(guān)腹。術(shù)后觀察動物一般狀況，每周稱重，第4周小鼠尾部取血10 μl檢測血清尿素氮(BUN)水平，確認(rèn)是否成模；如未成模，可給予高蛋白食物喂養(yǎng)2周以加速成模。

標(biāo)本留取及處理造模后給予配對飲食，8周稱重后，斷頭取血，分離血清。迅速分離脛骨前肌稱重，在生理位置固定后，OCT包埋，迅速液氮冷凍后，置-80°冰箱保存。剝離腓腸肌，液氮冷凍保存。

骨骼肌纖維免疫組化檢測脛骨前肌冰凍切片5 μm，用預(yù)冷的丙酮固定10 min；加蛋白終止液(protein blocker，Dako)終止15～30 min后，加入一抗anti-GCR和anti-Laminine(按1∶200稀釋)；濕盒中4℃過夜；PBST洗5 min×3次；加入熒光二抗，室溫下避光30 min；PBST洗10 min×2次，封片；熒光顯微鏡(NIKON eclipse 80i)下觀察，取600個肌纖維測量其橫截面積，Image software分析并計算肌纖維橫截面積的百分位分布圖。

實時熒光定量(Q-PCR)檢測mRNA表達(dá)腓腸肌總RNA提取用氯仿-異丙醇法。取2 μg RNA為模板，Oligo(dT)為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR Supermix熒光染料法進(jìn)行Real-time PCR。引物序列，Atrogin-1(F:5’GCAAACACTGCCACATTCTCTC，R:5’CTTGAGGGGAAAGTGAGACG)；MuRF-1(F:5’AAATGCTATGGAGAACCTGGA，R:5’GTCCTTGGAAGATGCTTTGTAA);3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(F:5’TCAACAGCAACTCCCACTCTTCCA，R:5’ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA)；擴(kuò)增結(jié)果用GAPDH為內(nèi)參照計算mRNA相對表達(dá)量。

Western Blot檢測Atrogin-1和MuRF-1蛋白表達(dá)及信號通路用CellLyticTMMT組織裂解液(Sigma)提取腓腸肌總蛋白，考馬斯亮藍(lán)檢測蛋白濃度，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，加入一抗：anti-Atrogin-1(FBX032,everest BIOTECH,EB09088)；anti-MuRF-1(ECM Biosciences,MP3401)，anti-p-Akt/Akt、anti-p-FoxO1/FoxO1 (Cell signaling)，4℃過夜，PBST洗膜3次，加入熒光二抗donkey anti-goat/Rabbit IgG (Invitrogin,Alexa Fluor 680/800)，室溫下30 min，PBST洗膜3次，Odyssey紅外線成像掃描儀掃描(LiCor)，蛋白表達(dá)量用內(nèi)參照GAPDH校正。

ELISA方法檢測血清皮質(zhì)激素水平采用皮質(zhì)酮激素試劑盒(Cayman) 檢測，按說明書進(jìn)行。

統(tǒng)計方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

一般情況MGRKO后經(jīng)免疫組化分析顯示，肌纖維GCR染色陰性，Western Blot未見肌肉組織GCR陽性表達(dá)(圖1)。MGRKO不影響小鼠的生長發(fā)育，MGRKO小鼠外觀與lox/lox小鼠無差異。lox/lox-CTL和MGRKO-CTL組的小鼠活潑好動，皮毛有光澤，體重逐漸增加；lox/lox-CKD組小鼠活動遲緩，皮毛蓬松無光澤,體重增加緩慢；MGRKO-CKD小鼠活動略顯遲緩，皮毛無光澤，但體重?zé)o明顯下降。術(shù)后8周lox/lox-CKD組體重較lox/lox-CTL組明顯下降[(27.1±1.95)gvs(29.76±2.66)g,P<0.05]；MGRKO-CTL和MGRKO-CKD兩組間體重?zé)o明顯差異[(30.33±1.75)gvs(29.3±1.64)g,P>0.05](圖2 A)。經(jīng)檢測lox/lox-CKD和MGRKO-CKD兩組的BUN顯著升高，兩組間無差異 (28.64±2.52)mmol/Lvs(29.30±1.41) mmol/L,P>0.05](圖2B)；內(nèi)源性皮質(zhì)酮水平均升高11～13倍，兩組間亦無明顯差異[(6.632±0.781)μg/dlvs(7.114±0.942)μg/dl,P>0.05](圖2C)。上述結(jié)果提示MGRKO可減輕或阻止腎衰竭引起的體重下降。

圖1 Western Blot提示MGRKO小鼠肌纖維GCR成功敲除，免疫組化染色綠色熒光為GCR，紅色熒光為Laminine

脛骨前肌形態(tài)及肌纖維橫截面積lox/lox-CKD組較lox/lox-CTL組脛骨前肌略顯萎縮，肌肉濕重明顯降低[(6.4±0.1) mgvs(7.67±0.12)mg，P<0.05](圖2D)；肌纖維明顯變細(xì)，橫截面積亦較lox/lox-CTL組降低[(438.63±523.72)μm2vs(832.84±588.63)μm2,P<0.05]橫截面積百分位圖明顯左移。而MGRKO-CKD組的脛骨前肌仍較飽滿，肌肉濕重較MGRKO-CTL組略微降低 [(7.43±0.15) mgvs(8.13±0.24)mg,P<0.05]；lox/lox-CKD組肌纖維輕度萎縮，橫截面積較MGRKO-CTL組僅輕度降低[(1 658.81±587.27)μm2vs(1 869.63±642.48)μm2,P<0.05]，橫截面積百分位圖略左移(圖3)。上述結(jié)果提示腎衰竭可引起的骨骼肌消耗性營養(yǎng)不良，MGRKO可減輕或阻止腎衰竭可引起的肌肉消耗。

骨骼肌Atrogin-1、MuRF-1的表達(dá)實時熒光定量(Q-PCR)分析顯示，lox/lox-CKD組的腓腸肌Atrogin-1、MuRF-1 mRNA水平顯著升高3.17倍(P<0.01)；Atrogin-1 mRNA在MGRKO-CKD組僅輕度升高1.62倍(P<0.05),而MuRF-1 mRNA表達(dá)水平在MGRKO的CKD和CTL兩組間未見差異(圖4A)。Western Blot檢測結(jié)果：lox/lox-CKD組的腓腸肌Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平較lox/lox-CTL組升高3.48倍(P<0.01)、3.20倍(P<0.05)；而MGRKO-CKD組Atrogin-1蛋白表達(dá)水平僅比MGRKO-CTL組升高了1.53倍(P<0.05)，MuRF-1的蛋白表達(dá)則無明顯差異(P>0.05)(圖4B)。該結(jié)果提示MGRKO可下調(diào)腎衰竭時肌萎縮關(guān)鍵基因Atrogin-1、MuRF-1表達(dá)水平。

圖2 A：肌肉特異性糖皮質(zhì)激素受體基因敲除(MGRKO)-CKD組的體重較lox/lox-CKD組明顯改善；B、C：lox/lox-CKD和MGRKO-CKD兩組的血尿素氮水平和血清皮質(zhì)酮水平相當(dāng)；D：MGRKO-CKD組的脛骨前肌濕重較lox/lox-CKD組增加

圖3 A: Laminine染色顯示的骨骼肌形態(tài);B:肌肉橫截面積百分位圖

信號途徑分析由于Insulin/IGF1-PI3K-Akt/ FoxO是體內(nèi)調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的主要信號途徑，本研究檢測Akt/ FoxO1信號表達(dá)結(jié)果顯示，lox/lox-CKD組Akt磷酸化水平(pAkt/Akt)較lox/lox-CTL組顯著降低3.1倍，同時FoxO1磷酸化水平(pFoxO1/FoxO1)較lox/lox-CTL組降低2.3倍；而MGRKO-CKD組的磷酸化Akt水平較對照組僅降低0.78倍，F(xiàn)oxO1磷酸化水平僅降低0.59倍(圖4C)。該結(jié)果提示CKD狀態(tài)可損害Akt/FoxO1信號途徑，MGRKO可一定程度消除對Akt磷酸化影響，上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子FoxO1磷酸化，進(jìn)而下調(diào)肌萎縮關(guān)鍵基因的表達(dá)。

圖4 A：熒光定量(Q-PCR)分析Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表達(dá)；B：Western Blot分析腓腸肌Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)；C：Western Blot分析Akt/FoxO1信號通路

討 論

病理生理學(xué)研究曾經(jīng)提示在膿毒血癥、糖尿病、腫瘤、酸中毒、腎衰竭等分解代謝狀態(tài)下，eGC水平可明顯提高；無論是eGC還是人工合成的GC，均可降低骨骼肌蛋白質(zhì)合成，加速蛋白分解，引起肌肉蛋白質(zhì)消耗[6]。研究發(fā)現(xiàn)切除動物腎上腺或給予GC受體阻滯劑(RU-486)后，可抑制酸中毒、胰島素缺乏、饑餓或膿毒血癥狀態(tài)下的肌肉萎縮；若再次給予高于生理劑量的GC，又可出現(xiàn)肌肉萎縮[7]。研究認(rèn)為，GC誘發(fā)肌肉消耗的機(jī)制主要在于GC可抑制氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)入肌細(xì)胞，影響蛋白質(zhì)合成；CKD等慢性消耗狀態(tài)下，GC則主要通過UPS。UPS是生物體最主要的蛋白降解系統(tǒng)，主要由泛素、泛素相關(guān)酶和蛋白酶體三部分組成，兩條肌肉特異性的E3連接酶：Atrogin-1和 MuRF-1在肌萎縮時顯著激活，編碼Atrogin-1和MuRF-1的基因可能是控制肌肉蛋白分解的關(guān)鍵基因[8，9]。最近我們的研究發(fā)現(xiàn)，生理劑量的GC可加劇胰島素受體敲除小鼠(MIRKO)的肌肉蛋白分解；而MGRKO的轉(zhuǎn)基因小鼠，可抵抗糖尿病引起的肌肉消耗，并使Atrogin-1表達(dá)下調(diào)[10]。但MGRKO是否可抵抗CKD的肌肉消耗，值得進(jìn)一步研究。因此，我們觀察了MGRKO小鼠在CKD狀態(tài)下的骨骼肌形態(tài)，及肌萎縮關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。

腎衰竭引起的骨骼肌消耗性營養(yǎng)不良表現(xiàn)為一定程度的體重下降和肌肉萎縮，MGRKO可減輕或阻止腎衰竭引起的肌肉消耗。lox/lox和MGRKO兩組的CKD模型，雖然其腎功能損害程度(BUN水平)和eGC水平相當(dāng)，但lox/lox-CKD組的體重和骨骼肌(脛骨前肌)濕重明顯下降，肌纖維明顯變細(xì)；而MGRKO-CKD上述改變則很輕微，證實MGRKO可減輕或阻止腎衰竭引起的肌肉消耗；同時熒光定量PCR和Western Blot分析，證實在lox/lox-CKD組，Atrogin-1、MuRF-1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著上調(diào)；而在MGRKO-CKD組Atrogin-1、MuRF-1下調(diào)，表明MGRKO可抵抗CKD狀態(tài)下肌萎縮關(guān)鍵基因激活和蛋白表達(dá)。

GC引起肌肉消耗的細(xì)胞內(nèi)信號途徑主要與激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor,FoxO)有關(guān)。FoxO1是Forkhead轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族的一員，是胰島素/胰島素樣生長因子1(Insulin/IGF-1)信號通路中的關(guān)鍵下游分子，直接受上游分子磷酸肌醇三激酶(PI3K)/蘇氨酸激酶(Akt)磷酸化作用調(diào)節(jié)[11]。FoxO1活性與磷酸化狀態(tài)直接相關(guān)，被磷酸化后便被排斥到細(xì)胞核外，若去磷酸化便移位至細(xì)胞核內(nèi)，F(xiàn)oxO1穿梭于細(xì)胞核內(nèi)外，在機(jī)體代謝狀態(tài)下精確控制Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)。體內(nèi)和體外研究均證實FoxO1尤其在能量消耗性疾病中高表達(dá)，并且是上調(diào)Atrogin-1和MuRF-1的關(guān)鍵因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，lox/lox-CKD的Akt磷酸化水平顯著降低3.1倍，同時FoxO1磷酸化水平(pFoxO1/FoxO1)較CTL組降低2.3倍；而MGRKO-CKD組的pAkt、 pFoxO1水平較對照組僅輕度降低，提示CKD狀態(tài)可損害Akt/FoxO1信號途徑，MGRKO可阻斷GC對Akt/mTOR途徑的影響，上調(diào)pFoxO1，進(jìn)而阻斷E3連接酶Atrogin-1、MuRF-1啟動轉(zhuǎn)錄。Schakman等[13]給予肌肉局部過表達(dá)IGF-1，可以拮抗地塞米松引起的骨骼肌萎縮。我們近期研究揭示GC可通過非基因性的競爭作用，損害胰島素信號通路，降低胰島素受體底物1(IRS-1)相關(guān)的 PI3K/Akt活性，并激活使肌萎縮關(guān)鍵基因Atrogin-1、MuRF-1表達(dá)升高，導(dǎo)致肌萎縮[10]。

綜上所述，本研究提示GC在CKD肌肉消耗中發(fā)揮重要作用，MGRKO可減輕或阻止CKD狀態(tài)下的體重下降和肌肉萎縮，下調(diào)肌萎縮關(guān)鍵基因Atrogin-1、MuRF-1表達(dá)水平；該效應(yīng)與阻斷GC影響Akt/FoxO1信號途徑有關(guān)；抑制GC信號通路可能改善CKD肌肉消耗。

(特別感謝美國Baylor醫(yī)學(xué)院腎臟病和內(nèi)分泌實驗室WE Mitch教授、胡兆永副研究員給予的幫助和支持)

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