• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    尾加壓素II 對大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)信號通路的影響

    2019-10-11 08:11:26支杏敏張捷邢明青盧東戴紅艷
    中國循環(huán)雜志 2019年9期
    關(guān)鍵詞:單克隆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)心肌細(xì)胞

    支杏敏,張捷,邢明青,盧東,戴紅艷

    研究發(fā)現(xiàn),尾加壓素Ⅱ(urotensin Ⅱ,UⅡ)是目前已知最有效的縮血管活性物質(zhì),其縮血管效能可達(dá)內(nèi)皮素-1 的10 倍[1],其分布具有種屬普遍性,目前在多種物種(包括人類)中都克隆出了UⅡ[2]。除此之外,UⅡ在多種細(xì)胞中均可表現(xiàn)出誘導(dǎo)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的作用,如UⅡ可以通過誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞、肝卵圓細(xì)胞等產(chǎn)生ROS,發(fā)揮促增殖作用[3-4]。在心肌細(xì)胞里,ROS 已被證實可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的上游信號分子的產(chǎn)生,從而參與調(diào)節(jié)并啟動細(xì)胞凋亡的過程[5-6]。但UⅡ?qū)π募〖?xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響尚不清楚。本研究為體外實驗,以UⅡ作為刺激因素,觀察其對心肌細(xì)胞OS 作用的影響,并探討其是否通過OS 途徑激活心肌細(xì)胞ERS 及其相關(guān)信號通路。

    1 材料與方法

    主要試劑和材料:新生1~2 天Wistar 大鼠乳鼠,清潔級(山東魯抗醫(yī)藥公司提供)。兔抗大鼠3 -磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)78(glucose-regulated protein, GRP78)多克隆抗體、小鼠抗大鼠活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)單克隆抗體購自英國Abcam 公司。UⅡ購自美國Sigma 公司,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、GAPDH 以及2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。TAKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司。胎牛血清(fatal bovine serun,F(xiàn)BS)、培 養(yǎng) 基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)購自美國Hyclone 公司。

    心肌細(xì)胞培養(yǎng):在無菌條件下,取新出生1~2天Wistar 大鼠乳鼠心臟,剪碎,用0.125%胰蛋白酶反復(fù)消化至組織全部消化,收集每次消化后的胰蛋白酶,用含20%FBS 的DMEM 低糖培養(yǎng)基終止消化。將收集的細(xì)胞懸液用200 母濾網(wǎng)過濾后離心、重懸,通過差速貼壁方法獲取心肌細(xì)胞,接種到35 cm3培養(yǎng)瓶或六孔板上,于37℃,5% CO2孵箱培養(yǎng)36 h 后進(jìn)行實驗。

    實驗設(shè)計:用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞36 h 后,將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4 組:正常對照組:無刺激培養(yǎng)48 h;尾加壓素Ⅱ處理組(UⅡ組):UⅡ 100 nmol/L 培養(yǎng)48 h;抗氧化劑NAC 預(yù)處理組(NAC 組):NAC 100 μmol/L 預(yù)處理組24 h 后,無刺激培養(yǎng)48 h;UⅡ+ NAC 組:NAC 100 μmol/L 預(yù)處理24 h 后,UⅡ100 nmol/L 培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后收集心肌細(xì)胞。

    細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測[7]:收集各組心肌細(xì)胞,用無血清DMEM 培養(yǎng)基清洗3 次,加入30μmol/L DCFH-DA 37℃下孵育20 min,不發(fā)光的DCFH-DA可以自由透過細(xì)胞膜, 細(xì)胞內(nèi)的ROS 可將DCFHDA 氧化成具有熒光的DCFH, 其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 的量成正比。再用無血清DMEM 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次, 以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用共聚焦顯微鏡獲得各組細(xì)胞圖像。采用image-pro plus 6.0 軟件進(jìn)行熒光密度分析。

    實時熒光定量PCR 檢測:按說明用TRIzol 提取心肌細(xì)胞總RNA,并用紫外分光光度計在260 nm下測量并計算RNA 的濃度及純度。根據(jù)TAKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并按2 μl 引 物(10 μmol),1 μl cDNA,8 μl 2×Taq PCR Master Mix,12 μl ddH2O,總反應(yīng)體積25 μl 的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件95℃,30 s。采用Promega 的SYBR?Green Ⅰ在熒光定量PCR 儀上擴(kuò)增,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)步驟:95℃,10 s,35 個循環(huán),62℃退火10 s;72℃延伸10 s 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,在每個循環(huán)的延伸期收集熒光信號,并通過熔解曲線分析PCR擴(kuò)增的特異性。所獲數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt法進(jìn)行處理。引物序列見表1。

    蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測:RIPA 細(xì)胞裂解液(RIPA lysis buffer)與蛋白酶抑制劑Aprotinin按250:1 比例消化收集的各組心肌細(xì)胞,冰上裂解30 min,劇烈震蕩3 次,高速離心機(jī)離心后取上清,加入適量蛋白上樣緩沖液,10 min 煮沸。用二喹啉甲酸(BCA)法[8]測定所得蛋白濃度。用10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳分離,并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,然后分別用GRP78 單克隆抗體(1:1 000)、ATF 單克隆抗體(1:160)、CHOP 單克隆抗體(1:1 000)和caspase-12 單克隆抗體(1:1 000)、GAPDH 單克隆抗體(1:1 000)4℃搖床孵育過夜,再與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,采用化學(xué)發(fā)光檢測法(ECL 顯色法)處理蛋白條帶。以GAPDH 為內(nèi)參,用Gelpro32 軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

    統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,并用±s 表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析,兩組間的數(shù)據(jù)比較采用成組t 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表1 引物序列

    2 結(jié)果

    UⅡ?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響(圖1、2):細(xì)胞免疫熒光法檢測結(jié)果,其中綠色熒光的深度代表ROS 的含量,共聚焦顯微鏡圖像(圖1),熒光密度分析值柱形圖(圖2)。UⅡ組心肌細(xì)胞中ROS 表達(dá)水平較UⅡ +NAC 組、正常對照組、NAC 組明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。

    圖1 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像

    圖2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的熒光密度分析值(n=3)

    UⅡ?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)信號通路的影響(圖3、4):通過qRT-PCR、Western blot 法檢測各組中ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的表達(dá)變化。UⅡ組中ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的mRNA 相對表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量均較UⅡ +NAC組、正常對照組、NAC 組明顯增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均<0.05)。

    圖3 qRT-PCR 法檢測UⅡ?qū)Ω鹘M細(xì)胞ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的mRNA 表達(dá)的影響 (n=3)

    圖4 Western blot 法檢測UⅡ?qū)Ω鹘M細(xì)胞ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的蛋白表達(dá)的影響(n=3)

    3 討論

    UⅡ是目前已知最有效的縮血管活性物質(zhì),且在多種細(xì)胞中均可表現(xiàn)出誘導(dǎo)OS、ROS 產(chǎn)生的作用[9-11]。本研究于體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,給予UⅡ刺激后,ROS 合成明顯增多,且此過程可被抗氧化劑所抑制,證實了UⅡ?qū)π募〖?xì)胞具有促進(jìn)OS 的作用,UⅡ可能通過促進(jìn)OS 作用,在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的致病作用。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細(xì)胞重要的Ca2+貯存器,也是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。多種因素如OS、低氧、高血糖、化學(xué)毒物等均可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+耗竭、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵錯配、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)向高爾基體轉(zhuǎn)運減少,導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積蓄等,從而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過減少蛋白質(zhì)翻譯、分子伴侶以及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)、增加未折疊蛋白質(zhì)降解等途徑力圖使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài),這些變化統(tǒng)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]。此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶如GRP78、GRP94 和鈣網(wǎng)蛋白的產(chǎn)生都會相應(yīng)的提高[13], 其中GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白[14],會與錯誤折疊的蛋白或未折疊的蛋白相結(jié)合,阻止這些蛋白的合成并使它們在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重新排列折疊或進(jìn)入降解途徑,以便能夠修復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[15]。

    當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)以保護(hù)由ERS 所引起的細(xì)胞損傷,恢復(fù)細(xì)胞功能,包括暫停早期蛋白質(zhì)合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶的轉(zhuǎn)錄激活。UPR 通??杉せ? 種轉(zhuǎn)錄因子,引起未折疊的和錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)沉積降解[16-19]。這3 種轉(zhuǎn)錄因子分別為:肌醇酶1/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心信號1(IRE1/ERN1)、PEK 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(RERK/PEK)和ATF6。其中ATF6 為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種感受蛋白,是ERS 引起的細(xì)胞凋亡和自噬途徑中的一個重要的調(diào)節(jié)因子,它不僅能夠啟動ERS 的生存途徑,嚴(yán)重或長時間的ERS 損傷了ER 的功能時,同樣能夠啟動由ERS 所介導(dǎo)的凋亡信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以去除受損傷的細(xì)胞。ERS 誘導(dǎo)的下游凋亡信號通路包括[20-22]:153 生長停滯及DNA 損傷誘導(dǎo)基因153 (CHOP/GADDl53)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、caspase 通路。內(nèi)環(huán)境平穩(wěn)狀態(tài)下,CHOP和caspase-12 的表達(dá)很弱,當(dāng)穩(wěn)態(tài)失衡,細(xì)胞發(fā)生ERS,CHOP 和caspase-12 的表達(dá)明顯升高,過度表達(dá)的CHOP 和caspase-12 會促使細(xì)胞周期停滯或嚴(yán)重的會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

    本研究于體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,給予UⅡ刺激后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、UPR 轉(zhuǎn)錄因子ATF6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡信號分子CHOP、caspase-12的表達(dá)均明顯升高,提示UⅡ可以激活ERS 及其相關(guān)信號通路。目前越來越多的證據(jù)表明ROS 的產(chǎn)生和細(xì)胞蛋白的折疊有直接的聯(lián)系[23-24]。OS 和ROS的產(chǎn)生是ERS 過程中不可或缺的部分。在ERS 相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),OS 促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣的釋放并引起線粒體的再攝取[25]。因此,鈣的增加會加快新陳代謝及線粒體中ROS 生成[26],Ca2+的遷移或釋放與ERS 緊密相連。已有研究證實,OS 是改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)或失調(diào)一個重要信號[27]。我們的數(shù)據(jù)表明,UⅡ可以增加ROS 在心肌細(xì)胞的表達(dá)并可以一定程度上激活ERS 及其相關(guān)信號通路,且UⅡ組預(yù)處理抗氧化劑NAC 后,UⅡ誘導(dǎo)的 ROS、ERS 及其相關(guān)信號通路表達(dá)均顯著降低。既往研究已經(jīng)證實,心肌梗死、心力衰竭、糖尿病性心肌病等情況下,心肌細(xì)胞UⅡ表達(dá)均增加,但其參與心臟重構(gòu)的機(jī)制未完全明了。基于前述結(jié)果我們得出,在所有UⅡ表達(dá)增高的病理狀態(tài)下,UⅡ可以先激活OS,進(jìn)而激活ERS 途徑,且此過程有ATF6、CHOP、caspase-12等信號通路分子的參與,這是UⅡ參與心臟重構(gòu)的一個重要病理生理機(jī)制。

    總之,UⅡ可能通過OS 途徑激活心肌細(xì)胞ERS,且此過程有ATF6、CHOP、caspase-12 等信號通路分子的參與,此通路在UⅡ參與的心臟重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用,但UⅡ?qū)?xì)胞凋亡的影響還需進(jìn)一步深入研究。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    單克隆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)心肌細(xì)胞
    左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及其與疾病的關(guān)系研究進(jìn)展
    活血解毒方對缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響
    憤怒誘導(dǎo)大鼠肝損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進(jìn)展
    LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞RLE-6 TN內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡研究
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展
    槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細(xì)胞肥大
    TSH受體單克隆抗體研究進(jìn)展
    亚洲中文字幕日韩| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日本wwww免费看| 午夜免费鲁丝| 国产亚洲一区二区精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 色综合婷婷激情| 国产一区二区三区视频了| 他把我摸到了高潮在线观看| cao死你这个sao货| 女人被狂操c到高潮| 午夜日韩欧美国产| 男人舔女人的私密视频| 天堂√8在线中文| 桃红色精品国产亚洲av| 精品久久久久久久久久免费视频 | 激情视频va一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 丁香六月欧美| 国产精品影院久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品熟女少妇八av免费久了| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品在线美女| 捣出白浆h1v1| 国产成人av教育| 午夜免费鲁丝| av线在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| 一级片'在线观看视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 三上悠亚av全集在线观看| 捣出白浆h1v1| 99热网站在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 在线永久观看黄色视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 9色porny在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成人免费观看视频高清| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线观看舔阴道视频| 99久久人妻综合| 90打野战视频偷拍视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 不卡av一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 9色porny在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 在线免费观看的www视频| 亚洲五月婷婷丁香| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品国产亚洲在线| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品成人在线| 免费在线观看日本一区| 大型黄色视频在线免费观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品国产一区二区精华液| 女性被躁到高潮视频| 精品一区二区三卡| 黄片大片在线免费观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲人成77777在线视频| 精品无人区乱码1区二区| 热re99久久国产66热| 国产精品影院久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产野战对白在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美日韩av久久| 黄色女人牲交| 69精品国产乱码久久久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精华国产精华精| 国产人伦9x9x在线观看| 男人舔女人的私密视频| 大型av网站在线播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩欧美三级三区| 美女 人体艺术 gogo| 日韩免费高清中文字幕av| tube8黄色片| 在线看a的网站| 国产成人啪精品午夜网站| 黄色成人免费大全| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品高清国产在线一区| 999久久久精品免费观看国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久精品区二区三区| 国产在线一区二区三区精| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产亚洲欧美在线一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久九九热精品免费| 十分钟在线观看高清视频www| 两个人看的免费小视频| 欧美乱色亚洲激情| 天堂俺去俺来也www色官网| 乱人伦中国视频| 一进一出好大好爽视频| 亚洲av电影在线进入| 亚洲人成电影观看| 国产97色在线日韩免费| 看片在线看免费视频| 麻豆成人av在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| av片东京热男人的天堂| 久热爱精品视频在线9| 午夜免费观看网址| 久久九九热精品免费| 国产1区2区3区精品| 亚洲 国产 在线| 亚洲九九香蕉| 国产高清videossex| 999精品在线视频| 亚洲av电影在线进入| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利,免费看| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲午夜理论影院| avwww免费| 超色免费av| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产又爽黄色视频| 波多野结衣一区麻豆| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精华国产精华精| 精品国产乱子伦一区二区三区| 乱人伦中国视频| 天天操日日干夜夜撸| 国产日韩一区二区三区精品不卡| ponron亚洲| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品 欧美亚洲| 婷婷成人精品国产| 大型av网站在线播放| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久精品亚洲av国产电影网| 无限看片的www在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 免费不卡黄色视频| 国产视频一区二区在线看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲综合色网址| 一区二区三区激情视频| 视频区欧美日本亚洲| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久中文看片网| bbb黄色大片| 女性被躁到高潮视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 777米奇影视久久| 中文亚洲av片在线观看爽 | 香蕉久久夜色| 国产不卡av网站在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品福利观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品久久久av美女十八| av视频免费观看在线观看| 五月开心婷婷网| 香蕉丝袜av| 一级作爱视频免费观看| 亚洲综合色网址| 99热网站在线观看| 精品第一国产精品| 午夜福利影视在线免费观看| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 男女之事视频高清在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美在线黄色| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 俄罗斯特黄特色一大片| 正在播放国产对白刺激| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品熟女少妇八av免费久了| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人精品无人区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 女同久久另类99精品国产91| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲情色 制服丝袜| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av电影在线进入| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产一卡二卡三卡精品| 成人免费观看视频高清| 国产成人影院久久av| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产一区二区三区综合在线观看| 超色免费av| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲少妇的诱惑av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 大码成人一级视频| 热99国产精品久久久久久7| 在线观看一区二区三区激情| 日本a在线网址| 99久久综合精品五月天人人| 9热在线视频观看99| 国产av一区二区精品久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 人人澡人人妻人| 亚洲精品中文字幕在线视频| 夜夜爽天天搞| 热99国产精品久久久久久7| 99在线人妻在线中文字幕 | 精品久久久久久,| 波多野结衣一区麻豆| 9热在线视频观看99| 露出奶头的视频| 91大片在线观看| 色在线成人网| 免费在线观看亚洲国产| 三上悠亚av全集在线观看| 又大又爽又粗| 99国产精品一区二区三区| 国产精品九九99| 日韩欧美在线二视频 | 国产精品免费大片| 国产在线一区二区三区精| 成人手机av| 亚洲国产精品合色在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久国产精品麻豆| 正在播放国产对白刺激| 国产主播在线观看一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 少妇粗大呻吟视频| 久久九九热精品免费| 手机成人av网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 人人澡人人妻人| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜精品国产一区二区电影| 男人操女人黄网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 欧美日韩黄片免| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美在线一区亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品免费一区二区三区在线 | 亚洲精品在线观看二区| 欧美日韩视频精品一区| 成人特级黄色片久久久久久久| 18禁美女被吸乳视频| 真人做人爱边吃奶动态| 成年人免费黄色播放视频| 国产片内射在线| 日本欧美视频一区| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲三区欧美一区| 成在线人永久免费视频| 国产1区2区3区精品| 欧美在线黄色| 欧美色视频一区免费| 岛国在线观看网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 窝窝影院91人妻| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 色婷婷av一区二区三区视频| 嫩草影视91久久| 国产精品成人在线| 国产视频一区二区在线看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美午夜高清在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 久热这里只有精品99| 国产欧美亚洲国产| 久久人妻av系列| 久热这里只有精品99| 91麻豆av在线| 一级a爱片免费观看的视频| 很黄的视频免费| 三上悠亚av全集在线观看| 久久九九热精品免费| 麻豆成人av在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| av一本久久久久| 亚洲全国av大片| 最近最新免费中文字幕在线| 久久 成人 亚洲| avwww免费| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲五月色婷婷综合| 美女高潮到喷水免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲在线自拍视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 很黄的视频免费| 久久国产精品影院| 免费在线观看完整版高清| 中亚洲国语对白在线视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产欧美日韩一区二区精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲成人国产一区在线观看| 免费不卡黄色视频| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲成国产人片在线观看| 一级黄色大片毛片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 天天操日日干夜夜撸| 日日爽夜夜爽网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美乱妇无乱码| 不卡av一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 色综合欧美亚洲国产小说| 999久久久国产精品视频| a级毛片在线看网站| 脱女人内裤的视频| 国产一卡二卡三卡精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 午夜成年电影在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 精品人妻在线不人妻| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 大片电影免费在线观看免费| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲精品一二三| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费在线观看完整版高清| 欧美久久黑人一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费 | 日韩欧美免费精品| 757午夜福利合集在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 18禁美女被吸乳视频| 老司机亚洲免费影院| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品久久视频播放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久午夜亚洲精品久久| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品亚洲成a人片在线观看| 性少妇av在线| 国产精品久久久av美女十八| 夫妻午夜视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 脱女人内裤的视频| 天天添夜夜摸| www日本在线高清视频| 满18在线观看网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 91国产中文字幕| 一区二区三区激情视频| 久99久视频精品免费| 18禁观看日本| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看免费视频网站a站| www.熟女人妻精品国产| 99热只有精品国产| 99精品在免费线老司机午夜| 成在线人永久免费视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 天天添夜夜摸| www日本在线高清视频| 亚洲黑人精品在线| 国产亚洲一区二区精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品人妻1区二区| 狂野欧美激情性xxxx| av在线播放免费不卡| 国产精品永久免费网站| 一二三四社区在线视频社区8| 国精品久久久久久国模美| 视频区欧美日本亚洲| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 91av网站免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 成人手机av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产97色在线日韩免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 色综合婷婷激情| 国产伦人伦偷精品视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| a在线观看视频网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美大码av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 91麻豆av在线| 国产精品免费一区二区三区在线 | 欧美午夜高清在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产男女超爽视频在线观看| 老司机亚洲免费影院| 视频在线观看一区二区三区| ponron亚洲| 亚洲免费av在线视频| 成年动漫av网址| 9色porny在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品福利永久在线观看| 老司机亚洲免费影院| 久久中文字幕一级| 中亚洲国语对白在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 青草久久国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜久久久在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 国产1区2区3区精品| 欧美日韩乱码在线| 久久国产精品影院| 一进一出抽搐动态| 99re在线观看精品视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 中出人妻视频一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜日韩欧美国产| 电影成人av| 国产成人欧美| 亚洲成国产人片在线观看| 丰满的人妻完整版| 91精品国产国语对白视频| 免费观看人在逋| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一a级毛片在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 一个人免费在线观看的高清视频| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美乱妇无乱码| 男女午夜视频在线观看| 国产高清videossex| 国产一区二区激情短视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 十八禁人妻一区二区| 91字幕亚洲| 国产亚洲欧美精品永久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲人成电影观看| 国产男靠女视频免费网站| 成人18禁在线播放| 久久久国产精品麻豆| 9热在线视频观看99| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲少妇的诱惑av| 久久ye,这里只有精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费观看精品视频网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲欧美激情综合另类| 新久久久久国产一级毛片| 在线播放国产精品三级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲色图综合在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 12—13女人毛片做爰片一| 中出人妻视频一区二区| www.999成人在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品影院久久| 久久ye,这里只有精品| 免费高清在线观看日韩| 国产视频一区二区在线看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产av一区二区精品久久| 一级毛片高清免费大全| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品免费视频内射| aaaaa片日本免费| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 男女午夜视频在线观看| 久久热在线av| 男女之事视频高清在线观看| 国产成人欧美| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 成年动漫av网址| 一区二区三区国产精品乱码| 视频在线观看一区二区三区| 精品亚洲成a人片在线观看| 精品第一国产精品| 18禁美女被吸乳视频| 飞空精品影院首页| 亚洲欧美激情综合另类| 巨乳人妻的诱惑在线观看| www.熟女人妻精品国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久热在线av| 在线天堂中文资源库| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人欧美在线观看 | 免费在线观看黄色视频的| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 99热网站在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| svipshipincom国产片| 亚洲av美国av| 91精品国产国语对白视频| 国产有黄有色有爽视频| 9热在线视频观看99| 亚洲人成电影观看| 午夜视频精品福利| 操美女的视频在线观看| av在线播放免费不卡| 两个人看的免费小视频| 国产一区二区激情短视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 香蕉国产在线看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 少妇的丰满在线观看| 另类亚洲欧美激情| 国产99久久九九免费精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 999精品在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 91大片在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 97人妻天天添夜夜摸| 99热网站在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 下体分泌物呈黄色| 色婷婷av一区二区三区视频| 十八禁网站免费在线| 九色亚洲精品在线播放| 免费不卡黄色视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 天堂√8在线中文| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产单亲对白刺激| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 99国产精品免费福利视频| 97人妻天天添夜夜摸| 成人国语在线视频| 国产精品九九99| 成人特级黄色片久久久久久久| 高清av免费在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观|