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    尾加壓素II 對大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)信號通路的影響

    2019-10-11 08:11:26支杏敏張捷邢明青盧東戴紅艷
    中國循環(huán)雜志 2019年9期
    關(guān)鍵詞:單克隆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)心肌細(xì)胞

    支杏敏,張捷,邢明青,盧東,戴紅艷

    研究發(fā)現(xiàn),尾加壓素Ⅱ(urotensin Ⅱ,UⅡ)是目前已知最有效的縮血管活性物質(zhì),其縮血管效能可達(dá)內(nèi)皮素-1 的10 倍[1],其分布具有種屬普遍性,目前在多種物種(包括人類)中都克隆出了UⅡ[2]。除此之外,UⅡ在多種細(xì)胞中均可表現(xiàn)出誘導(dǎo)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的作用,如UⅡ可以通過誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞、肝卵圓細(xì)胞等產(chǎn)生ROS,發(fā)揮促增殖作用[3-4]。在心肌細(xì)胞里,ROS 已被證實可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的上游信號分子的產(chǎn)生,從而參與調(diào)節(jié)并啟動細(xì)胞凋亡的過程[5-6]。但UⅡ?qū)π募〖?xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響尚不清楚。本研究為體外實驗,以UⅡ作為刺激因素,觀察其對心肌細(xì)胞OS 作用的影響,并探討其是否通過OS 途徑激活心肌細(xì)胞ERS 及其相關(guān)信號通路。

    1 材料與方法

    主要試劑和材料:新生1~2 天Wistar 大鼠乳鼠,清潔級(山東魯抗醫(yī)藥公司提供)。兔抗大鼠3 -磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)78(glucose-regulated protein, GRP78)多克隆抗體、小鼠抗大鼠活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)單克隆抗體購自英國Abcam 公司。UⅡ購自美國Sigma 公司,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、GAPDH 以及2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。TAKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司。胎牛血清(fatal bovine serun,F(xiàn)BS)、培 養(yǎng) 基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)購自美國Hyclone 公司。

    心肌細(xì)胞培養(yǎng):在無菌條件下,取新出生1~2天Wistar 大鼠乳鼠心臟,剪碎,用0.125%胰蛋白酶反復(fù)消化至組織全部消化,收集每次消化后的胰蛋白酶,用含20%FBS 的DMEM 低糖培養(yǎng)基終止消化。將收集的細(xì)胞懸液用200 母濾網(wǎng)過濾后離心、重懸,通過差速貼壁方法獲取心肌細(xì)胞,接種到35 cm3培養(yǎng)瓶或六孔板上,于37℃,5% CO2孵箱培養(yǎng)36 h 后進(jìn)行實驗。

    實驗設(shè)計:用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞36 h 后,將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4 組:正常對照組:無刺激培養(yǎng)48 h;尾加壓素Ⅱ處理組(UⅡ組):UⅡ 100 nmol/L 培養(yǎng)48 h;抗氧化劑NAC 預(yù)處理組(NAC 組):NAC 100 μmol/L 預(yù)處理組24 h 后,無刺激培養(yǎng)48 h;UⅡ+ NAC 組:NAC 100 μmol/L 預(yù)處理24 h 后,UⅡ100 nmol/L 培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后收集心肌細(xì)胞。

    細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測[7]:收集各組心肌細(xì)胞,用無血清DMEM 培養(yǎng)基清洗3 次,加入30μmol/L DCFH-DA 37℃下孵育20 min,不發(fā)光的DCFH-DA可以自由透過細(xì)胞膜, 細(xì)胞內(nèi)的ROS 可將DCFHDA 氧化成具有熒光的DCFH, 其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 的量成正比。再用無血清DMEM 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次, 以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用共聚焦顯微鏡獲得各組細(xì)胞圖像。采用image-pro plus 6.0 軟件進(jìn)行熒光密度分析。

    實時熒光定量PCR 檢測:按說明用TRIzol 提取心肌細(xì)胞總RNA,并用紫外分光光度計在260 nm下測量并計算RNA 的濃度及純度。根據(jù)TAKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并按2 μl 引 物(10 μmol),1 μl cDNA,8 μl 2×Taq PCR Master Mix,12 μl ddH2O,總反應(yīng)體積25 μl 的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件95℃,30 s。采用Promega 的SYBR?Green Ⅰ在熒光定量PCR 儀上擴(kuò)增,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)步驟:95℃,10 s,35 個循環(huán),62℃退火10 s;72℃延伸10 s 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,在每個循環(huán)的延伸期收集熒光信號,并通過熔解曲線分析PCR擴(kuò)增的特異性。所獲數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt法進(jìn)行處理。引物序列見表1。

    蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測:RIPA 細(xì)胞裂解液(RIPA lysis buffer)與蛋白酶抑制劑Aprotinin按250:1 比例消化收集的各組心肌細(xì)胞,冰上裂解30 min,劇烈震蕩3 次,高速離心機(jī)離心后取上清,加入適量蛋白上樣緩沖液,10 min 煮沸。用二喹啉甲酸(BCA)法[8]測定所得蛋白濃度。用10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳分離,并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,然后分別用GRP78 單克隆抗體(1:1 000)、ATF 單克隆抗體(1:160)、CHOP 單克隆抗體(1:1 000)和caspase-12 單克隆抗體(1:1 000)、GAPDH 單克隆抗體(1:1 000)4℃搖床孵育過夜,再與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,采用化學(xué)發(fā)光檢測法(ECL 顯色法)處理蛋白條帶。以GAPDH 為內(nèi)參,用Gelpro32 軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

    統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,并用±s 表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析,兩組間的數(shù)據(jù)比較采用成組t 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表1 引物序列

    2 結(jié)果

    UⅡ?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響(圖1、2):細(xì)胞免疫熒光法檢測結(jié)果,其中綠色熒光的深度代表ROS 的含量,共聚焦顯微鏡圖像(圖1),熒光密度分析值柱形圖(圖2)。UⅡ組心肌細(xì)胞中ROS 表達(dá)水平較UⅡ +NAC 組、正常對照組、NAC 組明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。

    圖1 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像

    圖2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的熒光密度分析值(n=3)

    UⅡ?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)信號通路的影響(圖3、4):通過qRT-PCR、Western blot 法檢測各組中ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的表達(dá)變化。UⅡ組中ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的mRNA 相對表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量均較UⅡ +NAC組、正常對照組、NAC 組明顯增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均<0.05)。

    圖3 qRT-PCR 法檢測UⅡ?qū)Ω鹘M細(xì)胞ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的mRNA 表達(dá)的影響 (n=3)

    圖4 Western blot 法檢測UⅡ?qū)Ω鹘M細(xì)胞ATF6、GRP78、CHOP 和 caspase-12 的蛋白表達(dá)的影響(n=3)

    3 討論

    UⅡ是目前已知最有效的縮血管活性物質(zhì),且在多種細(xì)胞中均可表現(xiàn)出誘導(dǎo)OS、ROS 產(chǎn)生的作用[9-11]。本研究于體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,給予UⅡ刺激后,ROS 合成明顯增多,且此過程可被抗氧化劑所抑制,證實了UⅡ?qū)π募〖?xì)胞具有促進(jìn)OS 的作用,UⅡ可能通過促進(jìn)OS 作用,在心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的致病作用。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細(xì)胞重要的Ca2+貯存器,也是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。多種因素如OS、低氧、高血糖、化學(xué)毒物等均可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+耗竭、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵錯配、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)向高爾基體轉(zhuǎn)運減少,導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積蓄等,從而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過減少蛋白質(zhì)翻譯、分子伴侶以及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)、增加未折疊蛋白質(zhì)降解等途徑力圖使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài),這些變化統(tǒng)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]。此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶如GRP78、GRP94 和鈣網(wǎng)蛋白的產(chǎn)生都會相應(yīng)的提高[13], 其中GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白[14],會與錯誤折疊的蛋白或未折疊的蛋白相結(jié)合,阻止這些蛋白的合成并使它們在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重新排列折疊或進(jìn)入降解途徑,以便能夠修復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[15]。

    當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)以保護(hù)由ERS 所引起的細(xì)胞損傷,恢復(fù)細(xì)胞功能,包括暫停早期蛋白質(zhì)合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶的轉(zhuǎn)錄激活。UPR 通??杉せ? 種轉(zhuǎn)錄因子,引起未折疊的和錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)沉積降解[16-19]。這3 種轉(zhuǎn)錄因子分別為:肌醇酶1/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心信號1(IRE1/ERN1)、PEK 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(RERK/PEK)和ATF6。其中ATF6 為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種感受蛋白,是ERS 引起的細(xì)胞凋亡和自噬途徑中的一個重要的調(diào)節(jié)因子,它不僅能夠啟動ERS 的生存途徑,嚴(yán)重或長時間的ERS 損傷了ER 的功能時,同樣能夠啟動由ERS 所介導(dǎo)的凋亡信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以去除受損傷的細(xì)胞。ERS 誘導(dǎo)的下游凋亡信號通路包括[20-22]:153 生長停滯及DNA 損傷誘導(dǎo)基因153 (CHOP/GADDl53)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、caspase 通路。內(nèi)環(huán)境平穩(wěn)狀態(tài)下,CHOP和caspase-12 的表達(dá)很弱,當(dāng)穩(wěn)態(tài)失衡,細(xì)胞發(fā)生ERS,CHOP 和caspase-12 的表達(dá)明顯升高,過度表達(dá)的CHOP 和caspase-12 會促使細(xì)胞周期停滯或嚴(yán)重的會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

    本研究于體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,給予UⅡ刺激后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、UPR 轉(zhuǎn)錄因子ATF6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡信號分子CHOP、caspase-12的表達(dá)均明顯升高,提示UⅡ可以激活ERS 及其相關(guān)信號通路。目前越來越多的證據(jù)表明ROS 的產(chǎn)生和細(xì)胞蛋白的折疊有直接的聯(lián)系[23-24]。OS 和ROS的產(chǎn)生是ERS 過程中不可或缺的部分。在ERS 相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),OS 促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣的釋放并引起線粒體的再攝取[25]。因此,鈣的增加會加快新陳代謝及線粒體中ROS 生成[26],Ca2+的遷移或釋放與ERS 緊密相連。已有研究證實,OS 是改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)或失調(diào)一個重要信號[27]。我們的數(shù)據(jù)表明,UⅡ可以增加ROS 在心肌細(xì)胞的表達(dá)并可以一定程度上激活ERS 及其相關(guān)信號通路,且UⅡ組預(yù)處理抗氧化劑NAC 后,UⅡ誘導(dǎo)的 ROS、ERS 及其相關(guān)信號通路表達(dá)均顯著降低。既往研究已經(jīng)證實,心肌梗死、心力衰竭、糖尿病性心肌病等情況下,心肌細(xì)胞UⅡ表達(dá)均增加,但其參與心臟重構(gòu)的機(jī)制未完全明了。基于前述結(jié)果我們得出,在所有UⅡ表達(dá)增高的病理狀態(tài)下,UⅡ可以先激活OS,進(jìn)而激活ERS 途徑,且此過程有ATF6、CHOP、caspase-12等信號通路分子的參與,這是UⅡ參與心臟重構(gòu)的一個重要病理生理機(jī)制。

    總之,UⅡ可能通過OS 途徑激活心肌細(xì)胞ERS,且此過程有ATF6、CHOP、caspase-12 等信號通路分子的參與,此通路在UⅡ參與的心臟重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用,但UⅡ?qū)?xì)胞凋亡的影響還需進(jìn)一步深入研究。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

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