診斷超聲結(jié)合左心聲學(xué)造影劑在血栓溶解方面的初步研究

王洋，林靜茹，王浩，朱振輝，逄坤靜，孟健，徐振雨，王學(xué)民，吳偉春

超聲檢查因其具有價廉、方便以及無輻射等優(yōu)點(diǎn)，一直是疾病診斷的首選檢查項目，但是近年來隨著新技術(shù)、新儀器和超聲造影劑的迅速發(fā)展，超聲已經(jīng)發(fā)展至治療領(lǐng)域。就血栓性疾病而言，臨床溶栓治療主要是使用藥物，并發(fā)癥較多[1-2]。新近報道超聲對其有明確溶栓作用的研究主要是在治療超聲照射下證實(shí)的，文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于診斷超聲溶栓的報道。我們于2018 年7 月至2019 年2 月采用診斷超聲條件，研究超聲造影劑聲諾維在診斷超聲照射下是否具有明顯的血栓溶解效果。

1 材料與方法

實(shí)驗試劑與儀器： Vivid E9 彩色多普勒超聲診斷儀（美國通用電氣公司，探頭包括線陣探頭L9和扇形探頭M5Sc）、AR3130 電子精密天平（Ohaus Corp.Pine Brook,Nj,美國）、恒溫水槽（上海森信實(shí)驗儀器有限公司）、超聲造影劑聲諾維（Bracco Suisse SA，意大利）、尿激酶（天津生物化學(xué)制藥有限公司）、0.9%生理鹽水（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）。

實(shí)驗材料：（1）血栓的制備：抽取新西蘭大白兔血液制成49 份血栓。具體方法是使用一次性靜脈輸液針從兔子耳緣靜脈抽取適量血液，然后在常溫下靜置3 h 左右，體外形成血栓條（直徑約0.4 cm，長約20 cm）。（2）造影劑的準(zhǔn)備：在使用前加入5 ml注射用生理鹽水（0.9%氯化鈉），用力振搖后形成微泡混懸液，然后備用。

實(shí)驗方法：（1）每份血栓在實(shí)驗前均用生理鹽水沖洗3 遍、濾紙吸干10 s，最后在千分之一天平上秤取其血栓的初始重量為W0。然后將49 份血栓隨機(jī)分為7 組：單純生理鹽水組（1 ml 生理鹽水與血栓作用180 min）；單純尿激酶組（濃度為10 000 U 的尿激酶1 ml 與血栓作用180 min）；單純造影劑組（聲諾維1 ml 與血栓作用180 min）；生理鹽水+超聲照射組（1 ml 生理鹽水與血栓作用150 min，超聲照射30 min）；尿激酶+超聲照射組（濃度為10 000 U 的尿激酶1 ml 與血栓作用150 min，超聲照射30 min）；造影劑+超聲照射組（聲諾維1 ml 與血栓作用150 min，超聲照射30 min）；造影劑+尿激酶+超聲照射組（聲諾維0.5 ml、濃度為10 000 U 的尿激酶0.5 ml，混合液與血栓作用150 min，超聲照射30 min）。將稱重好的血栓放入1.5ml 離心管中，管中試劑總量均為1 ml，離心管置于37°恒溫水槽中，超聲探頭放于水中，距離心管約2 cm 處垂直照射。照射完畢后，取出血栓，生理鹽水沖洗3 遍，濾紙吸干10 s 后天平秤取重量計為W1，計算溶栓率。溶栓率=[（W0-W1）/W0]×100%。（2）超聲照射采用GE 公司的Vivid E9 彩色多普勒超聲診斷儀，探頭包括線陣探頭L9（頭端接觸面為14 mm×53 mm），頻率2.4～10.0 MHz；扇形探頭M5Sc（頭端接觸面為17 mm×26 mm），頻率1.5～4.6 MHz。超聲照射頻率設(shè)為2 MHz、2.5 MHz、3 MHz，機(jī)械指數(shù)（MI）調(diào)至1.3,深度設(shè)為4 cm，增益、TGC 等參數(shù)均在實(shí)驗中保持不變。

病理分析:處理后的血栓組織由4%甲醛固定、脫水包埋制成石蠟塊，然后切片拷片、染色后封片，用全自動數(shù)字切片掃描機(jī)器觀察結(jié)果。該實(shí)驗用到的染色方法包括常規(guī)的蘇木素-伊紅染色以及改良馬松染色（麗春紅品紅染色液、磷鉬酸溶液、苯胺藍(lán)染色液）。

統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用單因素ANOVA 分析（方差分析）進(jìn)行組間均數(shù)比較和兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 診斷超聲結(jié)合超聲造影劑對體外血栓的溶解情況

經(jīng)過30 min 的診斷超聲照射，最后7 組血栓的溶解情況（表1～3）：在診斷超聲條件下，照射頻率為2 MHz、2.5 MHz 及3 MHz 時，無論是線陣探頭還是扇形探頭，單純尿激酶組溶栓率均較單純生理鹽水組明顯升高（P 均＜0.05）。生理鹽水+超聲照射組及造影劑+超聲照射組溶栓率均較尿激酶+超聲照射組及造影劑+尿激酶+超聲照射組明顯降低（P＜0.05），單純尿激酶組、尿激酶+超聲照射組和造影劑+尿激酶+超聲照射組3 組間溶栓率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；生理鹽水+超聲照射組和造影劑+超聲照射組比較，溶栓率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 診斷超聲（扇形探頭M5Sc） 頻率2 MHz、機(jī)械指數(shù) 1.3、輻照時間30 min 時各組的溶栓率（ n=7,±s）

表1 診斷超聲（扇形探頭M5Sc） 頻率2 MHz、機(jī)械指數(shù) 1.3、輻照時間30 min 時各組的溶栓率（ n=7,±s）

注： W0：血栓實(shí)驗前重量；W1：血栓實(shí)驗后重量。與單純生理鹽水組比較*P＜0.05;與尿激酶+超聲照射組比較ΔP＜0.05；與造影劑+尿激酶+超聲照射組比較▲P＜0.05

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表2 診斷超聲（扇形探頭M5Sc） 頻率2.5 MHz、機(jī)械指數(shù) 1.3、輻照時間30 min 時各組的溶栓率（ n=7,±s）

表2 診斷超聲（扇形探頭M5Sc） 頻率2.5 MHz、機(jī)械指數(shù) 1.3、輻照時間30 min 時各組的溶栓率（ n=7,±s）

注：W0：血栓實(shí)驗前重量；W1：血栓實(shí)驗后重量。與單純生理鹽水組比較*P＜0.05;與尿激酶+超聲照射組比較ΔP＜0.05；與造影劑+尿激酶+超聲照射組比較▲P＜0.05

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表3 診斷超聲（線陣探頭L9） 頻率3 MHz、機(jī)械指數(shù) 1.3、輻照時間30 min 時各組的溶栓率（ n=7,±s）

2.2 病理結(jié)果

蘇木素-伊紅染色顯微鏡下觀察結(jié)果：7 組血栓組織經(jīng)過染色后顯微鏡下呈現(xiàn)出相似的表現(xiàn)（圖1）：均由紅細(xì)胞、纖維蛋白以及少數(shù)炎癥細(xì)胞等構(gòu)成。紅細(xì)胞呈現(xiàn)出紅色的圓形結(jié)構(gòu)、散在分布或密集堆積排列；纖維蛋白呈現(xiàn)出淡粉色的片狀結(jié)構(gòu)；炎癥細(xì)胞呈現(xiàn)出藍(lán)紫色的小圓顆粒樣結(jié)構(gòu)。

改良馬松染色顯微鏡下觀察結(jié)果：7 組血栓組織經(jīng)過染色后顯微鏡下均可觀察到藍(lán)色的條帶狀、片狀結(jié)構(gòu)以及堆積的紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖2）。藍(lán)色區(qū)域處僅有散在分布的少數(shù)紅細(xì)胞，還含有一些炎癥細(xì)胞，藍(lán)色結(jié)構(gòu)大部分分布于血栓組織的邊緣。

圖1 七組血栓組織溶解后蘇木素-伊紅染色結(jié)果圖（×20）

圖2 七組血栓組織溶解后馬松染色結(jié)果圖（×10）

3 討論

文獻(xiàn)報道超聲對血栓的溶解作用主要表現(xiàn)在兩個方面：（1）超聲儀器及條件方面：超聲直接溶栓的作用機(jī)制尚未完全清楚[3-4]，目前認(rèn)為可能的原理主要包括空化作用、熱效應(yīng)以及機(jī)械效應(yīng)三個方面。有研究表明，超聲微泡溶栓、助溶作用機(jī)制主要是空化效應(yīng)。主要指液體中的微小氣泡在超聲波作用下發(fā)生振蕩、膨脹、收縮以及爆裂的一系列過程，這樣就能把能量聚焦出現(xiàn)溶栓作用。但是目前該方面的研究主要集中于治療超聲條件，使用的是治療超聲儀器，比如重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所研制的超聲治療儀器：低強(qiáng)度聚焦超聲儀器（LIFU），其參數(shù)多設(shè)置為低頻率[5]、高能量的治療條件，在這種條件下的溶栓作用是十分明確的。然而我們工作中使用的超聲儀器基本為診斷儀器，因為需要滿足對受檢人體安全無害的要求，所以設(shè)置的頻率相對較高、能量相對較低，而該條件下的溶栓效果卻鮮見報道；此外，高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）也可以對血栓起到明顯的溶解作用[6]。（2）微泡造影劑方面：目前國內(nèi)外已經(jīng)研制出多種具有明確溶栓作用的造影劑，該類型造影劑具有到達(dá)靶目標(biāo)（血栓）的能力，并在靶目標(biāo)處高濃度聚集且結(jié)合牢固[7]，而且在超聲探測期間能夠保持一定的穩(wěn)定性。比如MRX-408A1（可提高犬急性下腔靜脈血栓和犬急性左心耳血栓的顯示率，有區(qū)別急慢性血栓的能力）[8]和靶向超聲免疫脂質(zhì)體ELIPs（其可與抗纖維蛋白原結(jié)合，從而增強(qiáng)左心室血栓的超聲顯像）[9]，但是這些靶向溶栓造影劑均沒有在臨床上廣泛應(yīng)用，其中的原因可能與安全性、穩(wěn)定性等因素相關(guān)。目前國內(nèi)市售的安全穩(wěn)定的造影劑主要是意大利Bracco公司生產(chǎn)的聲諾維（SonoVue），這種造影劑未見有溶栓效果的報道。我們設(shè)想，如果對人體安全無害的診斷超聲儀器和安全穩(wěn)定的微泡造影劑聲諾維聯(lián)合使用，如果能夠出現(xiàn)明確的溶栓作用，那么對于臨床上許多栓塞性疾病的治療是一個福音。

本實(shí)驗研究結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析后，表明診斷超聲結(jié)合微泡造影劑聲諾維并沒有表現(xiàn)出明確的溶栓效果。其中的原因可能包括以下幾點(diǎn)：（1） 造影劑：因為聲諾維是普通造影劑，沒有親附血栓作用，所以不會特異性的在血栓處聚集，所以血栓處的空化效應(yīng)與其他位置的空化效應(yīng)并沒有顯著差異。此外，造影劑的劑量也是一個影響因素，在安全劑量的前提下血栓的溶解效果不明顯；（2）超聲照射時間：本實(shí)驗在照射30 min 后未出現(xiàn)明確的溶栓作用。根據(jù)文獻(xiàn)報道，超聲照射時間越長溶栓效果就越明顯，如果以此推測，本實(shí)驗結(jié)果可能與輻照時間短有關(guān)系，這也是本實(shí)驗組考慮到臨床實(shí)踐工作中的實(shí)際情況沒有做相關(guān)方面的進(jìn)一步研究；（3）超聲頻率：文獻(xiàn)報道超聲輻照頻率越低，溶栓效果越明顯。而治療超聲的頻率多小于1 MHz，在這個頻率范圍內(nèi)的溶栓效果是確切的，當(dāng)頻率大于1 MHz 時溶栓作用會減弱甚至不出現(xiàn)溶栓作用，本實(shí)驗限定在診斷超聲領(lǐng)域，而且使用的是臨床上常規(guī)使用的超聲診斷儀器，其頻率均大于1 MHz，在此條件下溶栓作用就相對較弱。

單純尿激酶組、尿激酶+超聲照射組和造影劑+尿激酶+超聲照射組3 組比較溶栓效果一致。眾所周知尿激酶是臨床上很成熟的溶栓藥，溶栓效果顯著，但是最大的副作用就是出血風(fēng)險，減少使用劑量可以降低這種情況的發(fā)生， “造影劑+尿激酶+超聲照射組”的尿激酶劑量是“單純尿激酶組” 和“尿激酶+超聲照射組”劑量的一半，所以“造影劑+尿激酶+超聲照射組”在安全性方面優(yōu)于“單純尿激酶組”和“尿激酶+超聲照射組”；而出于經(jīng)濟(jì)方面的考慮，“尿激酶+超聲照射組”優(yōu)于“造影劑+尿激酶+超聲照射組”。

血栓組織的病理染色結(jié)果表明：對于血栓溶解程度病理部分并沒有發(fā)現(xiàn)合適的定量指標(biāo)，而且由于實(shí)驗條件的限制本次實(shí)驗的病理部分只做了蘇木素-伊紅染色和改良馬松染色。蘇木素-伊紅染色顯示，由于紅細(xì)胞不是單層平鋪于載玻片上，而是堆積排列，所以通過紅細(xì)胞之間的空隙大小以及紅細(xì)胞排列的均勻程度難以準(zhǔn)確評價溶栓效果；此外，由于選取觀察視野的主觀性和隨機(jī)性，用紅細(xì)胞數(shù)量變化也難以客觀評價溶栓效果。馬松染色顯示，藍(lán)色區(qū)域為紅細(xì)胞破裂的主要區(qū)域，藍(lán)色區(qū)域越多則說明紅細(xì)胞被溶解的越多，但是對于這種變化沒有合適客觀的量化指標(biāo)。本實(shí)驗未進(jìn)行電鏡掃描觀察，電鏡下可以看到纖維網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，也許可以觀察到纖維網(wǎng)是否出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。

綜上所述，診斷超聲結(jié)合超聲造影劑（聲諾維）對血栓沒有明顯的溶解作用。單純尿激酶組、尿激酶+超聲照射組和造影劑+尿激酶+超聲照射組3組比較溶栓效果一致。出于安全方面的考慮，造影劑+尿激酶+超聲照射組優(yōu)于單純尿激酶組和尿激酶+超聲照射組；而出于經(jīng)濟(jì)方面的考慮，尿激酶+超聲照射組優(yōu)于造影劑+尿激酶+超聲照射組。該實(shí)驗為診斷超聲條件下血栓溶解的相關(guān)研究進(jìn)行了一些初步的嘗試，我們課題組也將繼續(xù)在相關(guān)方面做進(jìn)一步的深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突