雞大腸埃希菌I型菌毛pilA 基因的克隆與序列分析

王 東，張燕飛，蒲建明，丁林軍，王建波，王旭青，劉軍紅，吳 燕，殷 東，扈登強(qiáng)

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.吳忠市畜牧局，寧夏 吳忠 751100；3.銀川市農(nóng)業(yè)局，寧夏 銀川 750001；4.寧夏大學(xué)外國(guó)語(yǔ)學(xué)院2009級(jí)英語(yǔ)師范專業(yè)，寧夏 銀川 750021；5.寧夏博奧藥業(yè)有限公司，寧夏 銀川 750021）

大腸埃希菌是家禽最常見(jiàn)的病原菌之一，能引起家禽胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、卵黃性腹膜炎和全眼球炎等一系列疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。菌毛是雞大腸埃希菌重要的致病因子，在致病菌侵入雞體時(shí)起關(guān)鍵作用。雞大腸埃希菌有二類菌毛，即I型及P型菌毛，二者均由染色體編碼[2]。I型菌毛在禽大腸埃希菌感染過(guò)程中，可與禽呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體以一種“鑰匙－鎖”的方式特異性結(jié)合，從而黏附在宿主的粘膜和上皮表面，借以抵抗機(jī)體的機(jī)械清除和胃腸黏膜的蠕動(dòng)作用。結(jié)合后的大腸埃希菌不易被機(jī)體清除，很容易侵入呼吸道深部增殖，從而在致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。I型菌毛具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，此抗體與入侵細(xì)菌菌毛結(jié)合，封閉菌毛上受體結(jié)合位點(diǎn)，阻斷感染的第一個(gè)環(huán)節(jié)，從而防止禽大腸桿菌病的發(fā)生[4]。大腸埃希菌I型菌毛的編碼基因位于染色體上，由pil及相關(guān)基因簇編碼，其中pilA基因是編碼I型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位（FimA）的基因[5]，因此對(duì)I型菌毛pilA基因的研究對(duì)禽大腸桿菌病的診斷和防治工作具有重要意義。本研究根據(jù)雞大腸埃希菌I型菌毛pilA基因序列，在其同源區(qū)設(shè)計(jì)并合成引物，采用PCR技術(shù)，從3株雞大腸埃希菌地方分離菌株中分別擴(kuò)增和克隆I型菌毛pilA基因，并對(duì)克隆片段進(jìn)行序列測(cè)定和分析，為雞大腸桿菌病的診斷和I型菌毛基因工程疫苗的研制提供基因材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞大腸埃希菌25號(hào)菌株（O15）、57號(hào)菌株（O78）和58號(hào)菌株（O18），為寧夏地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型菌株[6]，由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從寧夏地區(qū)發(fā)病雞場(chǎng)分離并鑒定，均含有I型菌毛。受體菌DH5α為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 載體 PMD18－T Simple Vector為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑與酶 胰蛋白胨和酵母提取物為OXOID公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、EcoRⅠ為Fermantas公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為Promerga公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Platinum PCR Master Mix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雞大腸埃希菌基因組DNA的提取 參照天根生化科技（北京）有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank公布的雞大腸埃希菌I型菌毛pilA基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，加酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。上游引物為：5′－CATGCCATGGATGAAAATTAAAACTC－3′（劃線部分為Nco Ⅰ 酶切位點(diǎn)）；下游引物為：5′－CCGGAATTCTTATT－GATACTGAACC－3′（劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以提取的3株雞大腸埃希菌地方分離菌株基因組DNA為模板，利用合成的引物進(jìn)行I型菌毛pilA基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL（DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq Master Mix 25μL，滅菌超純水22 μL）。PCR擴(kuò)增條件：94℃3min；94℃1min，55℃30s，72℃30s，循環(huán)30次；72℃5min。以12g／L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物[7]。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳回收 參照天根生化科技（北京）有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 PCR產(chǎn)物與克隆載體的連接 參照寶生物工程（大連）有限公司pMD18－T－simple Vector說(shuō)明書(shū)，將pilA基因的PCR回收產(chǎn)物與pMD18－T－simple載體在4℃條件下連接16h。

1.2.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備 參照文獻(xiàn)[8]介紹的CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.7 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選 將10μL連接物加入200μL感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min，42℃熱激90s，冰浴1min；加入500μL SOB液體培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)1h；吸取100μL培養(yǎng)液涂布于加有適量Amp、X－gal及IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)12h～16h；挑選白色菌落，接種含Amp的LB培養(yǎng)液，37℃搖振培養(yǎng)16h。

1.2.8 質(zhì)粒DNA提取 參照天根生化科技（北京）有限公司質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.9 重組質(zhì)粒的鑒定 以提取的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR，陽(yáng)性質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用15g／L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.10 序列測(cè)定及分析 取PCR鑒定和酶切鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定；測(cè)序結(jié)果用DNA Man和DNA Star等生物軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸的同源性分析，繪制進(jìn)化樹(shù)；并對(duì)菌毛蛋白的抗原位點(diǎn)和抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 1型菌毛pilA基因的PCR擴(kuò)增

以提取的3株雞大腸埃希菌地方分離菌株基因組DNA為模板，利用合成的特異性引物，從雞大腸埃希菌25號(hào)菌株、57號(hào)菌株、58號(hào)菌株中分別擴(kuò)增出大小約為574bp的基因片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 雞大腸埃希菌pilA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of pilAgene from avian E.coli

2.2 重組質(zhì)粒pMD18－T－pilA 的鑒定

將PCR產(chǎn)物回收純化后連接pMD18－T－simple載體，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板后挑取白色菌落，接種含Amp的LB培養(yǎng)液，37℃搖振培養(yǎng)16h后提取質(zhì)粒，進(jìn)行重組質(zhì)粒pMD18－T－pilA的PCR鑒定。選擇PCR反應(yīng)為陽(yáng)性的質(zhì)粒，再用限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，電泳分析后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pMD18－T－pilA顯示兩個(gè)條帶，一條大小與574bp的目的基因條帶相近，另一條則與2.7 kb的pMD18－T克隆載體條帶大小相近（圖2），說(shuō)明得到含I型菌毛pilA基因的陽(yáng)性克隆。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18－T－pilA的酶切鑒定Fig.2 The identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

2.3 序列測(cè)定及分析

2.3.1 pilA基因的序列測(cè)定 挑選經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)測(cè)序報(bào)告，3個(gè)克隆片段全長(zhǎng)均為574bp，其中包括I型菌毛pilA基因全序列及完整的開(kāi)放性閱讀框架（ORF），片段大小為549bp，編碼信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)蛋白，說(shuō)明本試驗(yàn)所克隆的3株外源DNA為雞大腸埃希菌I型菌毛pilA基因。

2.3.2 pilA基因的同源性分析 利用DNA Man和DNA Star等生物軟件將本試驗(yàn)得到的序列與GenBank中已公布的雞大腸埃希菌I型菌毛pilA基因進(jìn)行同源性分析。由圖3和圖4看出，3株雞大腸埃希菌分離菌株pilA基因與其他菌株的核苷酸同源性為87.25%～98.36%，氨基酸同源性為87.36%～98.35%；3株雞大腸埃希菌分離菌株pilA基因之間的核苷酸同源性為91.44%～96.72%，氨基酸同源性為92.86%～97.80%。

圖3 雞大腸埃希菌pilA基因核苷酸同源性分析Fig.3 The nucleotide homology analysis of E.coli pilAgene from different strains

2.3.3 pilA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 將13株不同來(lái)源的大腸埃希菌pilA基因序列進(jìn)行聚類分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。

由圖5可知，3株雞大腸埃希菌分離菌株中58號(hào)菌株與其他菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；25號(hào)菌株與57號(hào)菌株的親緣關(guān)系較近；不同宿主來(lái)源的菌株可以位于相同的分支，如雞源大腸埃希菌57號(hào)菌株與人源大腸埃希菌的親緣關(guān)系較近；不同血清型菌株的親緣關(guān)系可以較近，如O1、O2、O24、O78位于同一分支；相同血清型菌株的親緣關(guān)系可以較遠(yuǎn)，如57號(hào)菌株（血清型為O78）與O78位于位于不同分支。

2.3.4 雞大腸埃希菌菌毛蛋白抗原位點(diǎn)和抗原表位分析 應(yīng)用DNAStar生物軟件，預(yù)測(cè)3株雞大腸埃希菌分離菌株菌毛蛋白的抗原位點(diǎn)和抗原表位，結(jié)果見(jiàn)表1和圖6。

由表1和圖6看出，3株不同血清型的雞大腸埃希菌分離菌株菌毛蛋白的抗原位點(diǎn)和抗原表位存在較大的相似性，但也有一定的差異，如25號(hào)菌株菌毛蛋白有6個(gè)主要抗原位點(diǎn)，與57號(hào)菌株和58號(hào)菌株相比，缺少1個(gè)抗原位點(diǎn)（100位～110位）；57號(hào)菌株和58號(hào)菌株都有7個(gè)主要抗原位點(diǎn)，但在部分抗原位點(diǎn)上存在抗原峰值的差異。

圖4 雞大腸埃希菌PilA蛋白氨基酸同源性分析Fig.4 The amino acide homology analysis of E.coli PilAprotein from different strains

圖5 雞大腸埃希菌pilA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 The phylogenetic tree of avian E.coli pilAgene

表1 雞大腸埃希菌菌毛蛋白抗原位點(diǎn)分析Table1 The analysis of antigenic sites of type I pili proteins from avian E.coli

圖6 雞大腸埃希菌菌毛蛋白抗原表位分析Fig.6 The epitope analysis of type I pili protein from avian E.coli

3 討論

大腸埃希菌I型菌毛的編碼基因位于染色體上，由pil及相關(guān)基因簇編碼，其中pilA基因是編碼I型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位（FimA）的基因[5]。分析已發(fā)表的雞大腸埃希菌I型菌毛pilA基因，在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)3株雞大腸埃希菌分離株pilA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收、連接、轉(zhuǎn)化等，將pilA基因連接到PMD18－T克隆載體上；通過(guò)PCR鑒定和酶切鑒定，得到574bp的克隆片段，其中包括I型菌毛pilA基因全序列及完整的開(kāi)放性閱讀框架（ORF），片段大小為549bp，編碼信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)蛋白；基因序列分析表明，3株雞大腸埃希菌分離菌株pilA基因與其他菌株的核苷酸同源性為87.25%～98.36%，氨基酸同源性為87.36%～98.35%，說(shuō)明本試驗(yàn)成功克隆3株不同血清型雞大腸埃希菌的I型菌毛pilA基因。

將13株不同來(lái)源的大腸埃希菌pilA基因序列進(jìn)行聚類分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，研究結(jié)果顯示，雖然菌株的宿主來(lái)源不同，但親緣關(guān)系可以相距較近，如雞大腸埃希菌57號(hào)菌株與人源大腸埃希菌位于相同的分支，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Suwanichkul A等[9]關(guān)于“人大腸埃希菌與雞大腸埃希菌I型菌毛源于同一祖先”的假說(shuō)，與高崧等[10－11]報(bào)道相似。雖然菌株的血清型不同，但親緣關(guān)系卻較近，如O1、O2、O24、O78位于同一分支；菌株的血清型相同，但親緣關(guān)系卻較遠(yuǎn)，如57號(hào)菌株（血清型為O78）與O78位于不同分支，說(shuō)明大腸埃希菌I型菌毛pilA基因的遺傳相似性與菌株的宿主來(lái)源及血清型沒(méi)有顯著的相關(guān)性，與于小娜等[12－13]報(bào)道相似。

對(duì)克隆的3株雞大腸埃希菌分離菌株I型菌毛pilA基因進(jìn)行序列測(cè)定和分析，結(jié)果表明，3株雞大腸埃希菌分離菌株pilA基因之間的核苷酸序列同源性為91.44%～96.72%，氨基酸序列同源性為92.86%～97.80%，說(shuō)明3株雞大腸埃希菌分離菌株I型菌毛pilA基因序列和氨基酸序列有較高的同源性。應(yīng)用DNA Star生物軟件，預(yù)測(cè)3株雞大腸埃希菌分離菌株菌毛蛋白的抗原位點(diǎn)和抗原表位，結(jié)果顯示，3株雞大腸埃希菌I型菌毛間具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，并存在一定的共同抗原位點(diǎn)，如25號(hào)菌株和57號(hào)菌株的菌毛蛋白主要抗原位點(diǎn)都位于50～60，65～75，80～90，115～120，125～130，140～150位氨基酸；57號(hào)菌株和58號(hào)菌株的7個(gè)主要抗原位點(diǎn)基本相同或相似。本實(shí)驗(yàn)室已完成雞大腸埃希菌天然I型菌毛亞單位疫苗的交叉保護(hù)性試驗(yàn)，證實(shí)雞大腸埃希菌25號(hào)（O15）、57號(hào)（O78）和58號(hào)（O18）菌株之間存在一定的交叉保護(hù)作用，與隋兆峰等[14－15]報(bào)道相似。本研究從分子水平為不同血清型雞大腸埃希菌I型菌毛間存在交叉保護(hù)作用的現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

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