豬博卡病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立

鄧 波，劉佩紅，周錦萍＊，王 建，劉 健，鞠厚斌，葛菲菲，崔 立，華修國(guó)

（1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2.上海交通大學(xué) 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

博卡病毒（Boka virus，BoV）屬于細(xì)小病毒科，而細(xì)小病毒科屬于最小、最簡(jiǎn)單的一類(lèi)單鏈線(xiàn)狀DNA病毒，包括感染鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的細(xì)小病毒亞科和感染節(jié)肢動(dòng)物的濃核病毒亞科2個(gè)亞家族。細(xì)小病毒亞科又包括5個(gè)屬，即細(xì)小病毒屬、紅病毒屬、依賴(lài)性病毒屬、貂阿留申病毒屬和博卡病毒屬[1]。

Blom strom A等[2]利用隨機(jī)多重置換擴(kuò)增方法 （random multiple displacement amplification，MDA）在患仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬淋巴結(jié)中擴(kuò)增出了一段長(zhǎng)1879bp的核苷酸序列，該段序列與已知病毒序列比較，發(fā)現(xiàn)其完整的NP1基因及部分VP1／VP2基因與人類(lèi)博卡病毒相近，故將該病毒暫時(shí)定義為豬博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）。PBoV在病豬體內(nèi)被檢出，暗示其對(duì)豬有一定的致病性。翟少倫等[3]于2010年建立一種檢測(cè)PBoV的PCR方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time fluorescent quantitative PCR，Real－time PCR）具有較高的特異性、靈敏度，以及可定量、有效解決PCR污染問(wèn)題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、微生物和動(dòng)植物檢疫方面得到廣泛應(yīng)用[4－6]。本研究目的在于建立Taq Man探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于檢測(cè)PBoV。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽(yáng)性樣品來(lái)源 陽(yáng)性樣品由上海交通大學(xué)上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，按照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行PCR檢測(cè)，并將產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序后通過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Agarose LE，Genebase Gene－Tech公司產(chǎn)品；6×loading buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸埃希菌，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)和篩選 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Bocavirus 5′端非編碼區(qū)的保守核苷酸序列 VP1／2區(qū)域，采用軟件 Primer Express 2.0（ABI公司）設(shè)計(jì)引物和Taq Man熒光探針序列，并通過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)驗(yàn)證（登錄號(hào)：FJ872544），篩選獲得的引物和探針如下：

PBo－F1：5＇TCAGAGATCGAGCTATACAACCG3＇；PBo－R2：5＇CTGTTTCGGAGATGTCCTTGC3＇；PBo－Probe：5＇－FAM－AGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCCT－BHQ－3＇；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，Taq Man探針由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司合成，PAGE純化。擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為85bp。

1.2.2 病毒DNA的抽提和模板的制備 病毒DNA的抽提選用血液病毒DNA快速提取試劑盒（LG－0105A），上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化、連接和轉(zhuǎn)化，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEMT－Vector載體中，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒。提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并送至上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)公司測(cè)序，并與GenBank中已知序列進(jìn)行比較。

1.2.3 PBoV實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化 擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：10×擴(kuò)增緩沖液6μL，4種dNTP混合物各200μmol／L，模板DNA2μL，Taq DNA聚合酶2U／μL，UNG酶Tris－HCl pH 8.6緩沖液5U／100μL，加雙或三蒸水至30μL。按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃，15s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。

確定反應(yīng)體系后，比較 Mg2＋濃度分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mmol／L下，引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2μmol／L下，探針終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol／L 下的PCR擴(kuò)增效果，選擇最適濃度[7]。每次檢測(cè)時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照（健康豬的基因組DNA）和水為模板的空白對(duì)照；在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立時(shí)，整個(gè)試驗(yàn)有效，可判定結(jié)果[8]。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 利用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增臨床保存的15例SPF豬血清、5份豬細(xì)小病毒（PPV）陽(yáng)性、5份豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）陽(yáng)性、5份豬圓環(huán)病毒（PCV）陽(yáng)性病料標(biāo)本，檢測(cè)其特異性。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 提取DNA質(zhì)粒，然后分級(jí)10倍稀釋成1×1010copies／μL～100copies／μL，分別取每一數(shù)量級(jí)稀釋液2μL作為PCR模板。在PCR的過(guò)程中由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)繪制線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。按照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行常規(guī)PCR，產(chǎn)物大小為496bp，比較兩種方法靈敏度的差異。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 以相同稀釋度質(zhì)粒作為模板，10倍梯度稀釋成3個(gè)不同梯度模板，重復(fù)10次反應(yīng)。并取質(zhì)粒和陰性血清稀釋液，提取核酸，重復(fù)多孔同步檢測(cè)，考察重復(fù)性[9]。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將檢測(cè)試劑放入4℃冰箱中及37℃恒溫箱中進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)，連續(xù)監(jiān)測(cè)7d反應(yīng)試劑檢測(cè)性能的變化，從而判斷反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 將101copies／μL～107copies／μL系列核酸樣品設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)品，以各標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)值為X軸，以Ct值為Y軸構(gòu)建定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

結(jié)果表明，不同Mg2＋濃度、引物和探針終濃度對(duì)結(jié)果影響較大，經(jīng)篩選后確定 Mg2＋濃度為3.5 mmol／L、引物濃度為0.2μmol／L和探針濃度0.2 μmol／L。各反應(yīng)條件優(yōu)化后，每次檢測(cè)的陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)Ct值，無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照的Ct值均小于31.00，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線(xiàn)基本上是重合的。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性結(jié)果顯示，只有PBoV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct值分別為29.48和30.01，判為陽(yáng)性。而其他病原和陰性對(duì)照均為陰性，表明建立的方法有較好的特異性（圖1、圖2）

圖1 15例SPF豬血清標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)擴(kuò)增圖Fig.1 Amplification curves of 15SPF serum sample templates

圖2 15例組織樣品PBoV R普通PCR檢測(cè)陰性標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PC檢測(cè)擴(kuò)增圖Fig.2 Amplification curves of 15negative sample templates

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)可檢測(cè)107copies／μL～101copies／μL病毒載量，區(qū)別于陰性對(duì)照的最低模板濃度即靈敏度為101copies／μL，即將質(zhì)粒以10倍倍比稀釋至濃度極限102copies／μL，多次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)得實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測(cè)最低限度為101DNA拷貝每30μL反應(yīng)體系（圖3）。

同時(shí)用普通PCR方法和熒光定量PCR方法對(duì)上海及周邊地區(qū)122份豬臨床內(nèi)臟樣本進(jìn)行豬博卡病毒檢測(cè)（表1）。結(jié)果表明有4份樣品熒光定量PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性，而普通PCR方法檢測(cè)為陰性。將4份陽(yáng)性產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序后通過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，同源性均在97%以上。

圖3 從左至右分別為107copies／μL～101copies／μL八個(gè)不同濃度豬博卡陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線(xiàn)Fig.3 From left to right：Amplification curves of（107copies／μL ～101copies／μL）PBoV plasmid templates

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

如表2結(jié)果所示，所有稀釋梯度下變異系數(shù)均在0.25%～0.54%左右，遠(yuǎn)小于其他研制試驗(yàn)報(bào)道[10]的變異系數(shù)（CV）6.66%和6.84%，表明本檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒檢測(cè)的重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

如表3、表4與圖4、圖5所示，4℃試驗(yàn)中PBoV－1、PBoV－2和PBoV－3變異系數(shù)分別為1.38%、5.44% 和 3.79%。37℃試驗(yàn)中分別為2.37%、1.71%、5.61%。4℃和37℃試驗(yàn)7d連續(xù)檢測(cè)后分析結(jié)果，其變異系數(shù)2%～5%左右，從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，檢驗(yàn)體系具有良好的穩(wěn)定性。

表1 兩種方法對(duì)博卡病毒檢測(cè)結(jié)果的比較Table1 The comparison results of two detection methods for PBoV

表2 重復(fù)性分析Table2 Repeatability analysis

表3 4℃穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table3 Stability test results at 4℃

表4 37℃穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table4 Stability test results at 37℃

圖4 4℃穩(wěn)定性定量結(jié)果分析Fig.4 Stability quantitative analysis at 4℃

圖5 37℃穩(wěn)定性定量結(jié)果分析Fig.5 Stability quantitative analysis at 37℃

2.6 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將稀釋的DNA設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖6）。由圖可知，曲線(xiàn)斜率為－3.857，模板濃度在107～101范圍內(nèi)有較好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997。在對(duì)送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可根據(jù)獲得的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算該樣品所含病毒數(shù)量，但所檢測(cè)到的只是病毒的DNA拷貝數(shù)，而非具有感染性的病毒顆粒。

圖6 Real－time PCR 標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.6 The standard curve for real－time PCR

3 討論

豬博卡病毒是最新發(fā)現(xiàn)的一種DNA病毒，為了及時(shí)地評(píng)估其在我市的流行情況，本研究根據(jù)GenBank上遞交的惟一一條豬博卡病毒核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，并建立了豬博卡病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法。Taq Man熒光探針?lè)ň哂锌焖?、特異性高、操作?jiǎn)便、重復(fù)性好、一次試驗(yàn)可以同時(shí)檢測(cè)大批量樣本等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)所用的Taq Man技術(shù)對(duì)于整個(gè)試驗(yàn)的擴(kuò)增檢測(cè)都是在一個(gè)密閉體系中進(jìn)行的，減少了擴(kuò)增體系本身以及其對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染[3]。本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以作為豬博卡病毒在臨床上的一種診斷技術(shù)。

本方法靈敏度檢測(cè)限度為101copies／μL；特異性方面，在對(duì)30例陰性標(biāo)本的檢測(cè)中未出現(xiàn)一例假陽(yáng)性。穩(wěn)定性試驗(yàn)，4℃試驗(yàn)中PBoV－1，PBoV－2，PBoV－3變異系數(shù)分別為1.38%，5.44%，3.79%。37℃試驗(yàn)中PBoV－1，PBoV－2，PBoV－3變異系數(shù)分別為2.37%、1.71%、5.61%4℃和37℃試驗(yàn)7d連續(xù)檢測(cè)后分析結(jié)果，其變異系數(shù)2%～5%左右，從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，本方法具有良好的穩(wěn)定性。

綜上所述，本試驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的方法，具有靈敏度高，特異性好，在對(duì)豬博卡病毒株的基因診斷中具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，適合做大規(guī)模臨床樣本的檢測(cè)。

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