TGF－β1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響

李 瑜，王鳳龍，丁旭娜，楊 磊，丁玉林

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

研究表明豬、山羊和牛乳腺退化期主要是通過細(xì)胞凋亡減少乳腺細(xì)胞數(shù)量[1]。乳腺內(nèi)乳汁積滯是誘導(dǎo)退化期乳腺凋亡的主要原因，退化期的乳腺凋亡除受到內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)外，局部細(xì)胞因子也成為研究退化期乳腺凋亡的焦點(diǎn)[2－3]。豬、山羊和牛等動物在乳腺退化期可以檢測到乳腺組織中β轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factorβ，TGF－β）3種亞型（TGF－β1、β2、β3）的 mRNA 表達(dá)上調(diào)，TGF－β過度表達(dá)，同時，還可以檢測到乳腺細(xì)胞凋亡水平增加[4]。用小鼠的乳腺上皮細(xì)胞系體外建立退化模型，也發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)DNA斷裂、形成凋亡小體等明顯的凋亡特征，同時TGF－β及其受體表達(dá)水平增加?？梢?，TGF－β是細(xì)胞凋亡的重要介導(dǎo)者[5－9]。

TGF－β1屬于寡二聚體多肽生長因子家族，表達(dá)于多種細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞等[10－11]。TGF－β1通過與相應(yīng)受體結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的分泌、分化、增殖及凋亡等多種過程[12－14]，該因子在體內(nèi)也可作為炎性因子參與炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促纖維化因子。研究發(fā)現(xiàn)，在體外TGF－β1通過阻止G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，從而對來源于上皮組織的細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，是目前已知的惟一能下調(diào)HGF表達(dá)的細(xì)胞因子，在正常細(xì)胞、癌變細(xì)胞中都有著顯著作用。迄今已發(fā)現(xiàn)許多與TGF－β1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前研究較多的有TGF－β1／Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TGF－β1／smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是TGF－β1誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞凋亡的主要途徑[15－16]。在細(xì)胞凋亡過程中caspases是引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)改變的關(guān)鍵執(zhí)行者。而將大鼠的TGF－β基因敲除后，乳腺組織的凋亡水平較低。轉(zhuǎn)染TGF－β1基因到妊娠期和哺乳期的大鼠乳腺中，與野生型大鼠相比轉(zhuǎn)基因大鼠的乳蛋白合成減少，產(chǎn)乳量下降，分泌上皮細(xì)胞的存活能力下降。本試驗(yàn)以TGF－β1作用于體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，以研究TGF－β1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響，將為進(jìn)一步探討和揭示乳腺疾病的發(fā)生機(jī)制供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物獸醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室分離、培養(yǎng)、純化和鑒定；TGF－β1、DMEM、胰蛋白酶、MTT為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；DMSO為Gibco公司產(chǎn)品；caspase－3分光光度法檢測試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Bio－tek公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長曲線繪制 倒置顯微鏡觀察第6代奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)判斷細(xì)胞生長狀況。用2.5g／L的胰蛋白酶溶液消化生長狀態(tài)良好的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，以含100mL／L血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化并稀釋細(xì)胞密度至5×104個／mL，接種于24孔培養(yǎng)板每孔接種500 μL，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24h細(xì)胞計(jì)數(shù)一次，制作奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長曲線。

1.2.2 TGF－β1 作用奶牛乳腺上皮細(xì)胞 用含100mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，取第6代對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。用含2.5 g／L胰蛋白酶0.2mL／L EDTA的消化液消化細(xì)胞5min，用含100mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。用于MTT法檢測TGF－β1對奶牛乳腺增殖的上皮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個／mL，用于分光光度法檢測caspase－3活性和二苯胺反應(yīng)法測定DNA片段化率的上皮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個／mL。按每孔100μL接種于96孔板。培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁完全，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，按每孔100μL加入無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為對照組、試驗(yàn)組。試驗(yàn)組用濃度為1、5、10ng／mL的 TGF－β1誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞3、6、12、24、48h，對照組加入無血清培養(yǎng)液每孔100μL，每個試驗(yàn)組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 MTT法檢測TGF－β1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響 誘導(dǎo)時間結(jié)束后，每孔加入20μL MTT溶液，輕振培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100μL DMSO，室溫震蕩10min～20min，于酶標(biāo)儀上測定570nm波長的測吸光值，試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.4 分光光度法檢測caspase－3活性 誘導(dǎo)時間結(jié)束后，收集各組細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，2000r／min離心5min，盡量去除上清，加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育40min，期間漩渦振蕩3次～4次，每次10s，10000r／min 4℃離心1min，吸取50μL上清液，同時加入50μL 2×Reaction buffer和5μL的caspase－3substrate，于37℃光孵育4h后，置酶標(biāo)測儀上測定405nm波長的吸光度值（OD），檢測誘導(dǎo)劑組caspase－3活化程度。

1.2.5 二苯胺反應(yīng)法測定DNA片段化比率 誘導(dǎo)時間結(jié)束后，收集各組細(xì)胞。1000r／min離心10 min，用PBS洗滌3次。沉淀物用0.5mL低滲溶解緩沖液于37℃溶破1.5h，溶破物15000r／min離心15min，上清液含有片段化DNA（以S1表示）。沉淀中加入高滲緩沖液50μL，室溫靜置30min后，15000r／min離心10min，上清液含有片段化DNA（以S2表示），沉淀以PP表示。合并S1和S2為S，加入等體積125mL／L三氯醋酸，15000 r／min，離心10min棄上清，收集沉淀（以SP表示）。SP和PP用125mL／L三氯醋酸洗滌3次后，分別加入100μL 125mL／L三氯醋酸，95℃加熱15 min。在樣品中分別加入100μL新鮮配制的40 mL／L二苯胺 溶液，95 ℃ 加熱 10min，15000 r／min，離心10min，取100μL上清至96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上讀取595nm吸光值。按公式：DNA片段化百分率＝SPA595／（SPA595＋PPA595）×100%計(jì)算DNA片段化百分率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 各試驗(yàn)組設(shè)置3個重復(fù)，每個試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)4次。采用SAS9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著表示為P＜0.05，差異極顯著表示為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

倒置顯微鏡觀察純化的乳腺上皮細(xì)胞，從形態(tài)上看奶牛乳腺上皮細(xì)胞排列緊密，呈鋪路石狀（圖1）。不同時間消化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制生長曲線，結(jié)果顯示生長曲線中細(xì)胞數(shù)量與時間成正相關(guān)狀態(tài)。其中1d～3d為潛伏期、3d～7d為細(xì)胞增殖期、7d～8d為對數(shù)生長期，而7d～11d為平臺期（圖2）。

圖1 純化的乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)觀察（200×）Fig.1 Purified mammary epithelial cells observed with microscope（200×）

圖2 純化乳腺上皮生長曲線Fig.2 Grow curve of purified mammary epithelial cells

2.2 TGF－β1對乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

檢測TGF－β1處理的第6代牛乳腺上皮細(xì)胞的活細(xì)胞570nm處的OD值。不同濃度TGF－β1處理細(xì)胞，波長570nm處的OD值隨時間逐漸降低呈一定的正量效關(guān)系，對照組細(xì)胞570nm處的OD值隨時間平緩增大。與對照組比較，1、5、10ng／mL TGF－β1各組對體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞均有抑制增殖作用（P＜0.05）（圖3）。1、5、10ng／mL TGF－β1組間比較，抑制增殖作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。不同濃度處理組與時間組間有交互作用（P＞0.05）。

圖3 MTT法檢測TGF－β1對乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of TGF－β1on mammary epithelial cell proliferation detected by MTT method

2.3 TGF－β1對乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

于酶標(biāo)測儀上檢測TGF－β1處理的第6代牛乳腺上皮細(xì)胞的活細(xì)胞，分光光度570nm處的OD值確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase－3活化程度。不同濃度TGF－β1處理組，培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞caspase－3的活性隨TGF－β1濃度的增大而平穩(wěn)的增高，呈一定的量效關(guān)系。經(jīng)方差分析，與對照組比較，5 ng／mL／和10ng／mL／TGF－β1均有抑制增殖作用（P＜0.05），1ng／mL／與對照組比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。不同濃度處理組與時間組間有交互作用（P＞0.05）。從結(jié)果分析各時間處理組中caspase－3的活性在6h時達(dá)到最大值，與其他時間點(diǎn)比較差異均顯著（P＜0.05），后逐漸降低并趨于平緩，3、12、24h時間點(diǎn)差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 caspase－3法檢測乳腺上皮細(xì)胞凋亡Fig.4 Mammary epithelial cell apoptosis detected by Caspase－3method

2.4 DNA片段化比率的檢測結(jié)果

于酶標(biāo)測儀上檢測TGF－β1處理的第6代牛乳腺上皮細(xì)胞的活細(xì)胞酶標(biāo)儀上讀取分光光度595 nm OD值，按公式DNA片段化百分率＝SPA595／（SPA595＋PPA595）×100%計(jì)算DNA片段化百分率，DNA片段化比率隨TGF－β1濃度升高而升高，呈量效關(guān)系。與對照組比較1、5、10ng／mL TGF－β1均有促進(jìn)凋亡作用（P＜0.05），3h和6h時間之間差異不顯著（P＞0.05），12、24、48h時間之間差異顯著（P＜0.05）（圖5）。不同濃度TGF－β1處理組和時間之間有交互作用（P＞0.05）。

圖5 二苯胺反應(yīng)法測定DNA片段化比率Fig.5 DNA fragments ratio detected by diphenylamine reaction

3 討論

TGF－β1屬調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的轉(zhuǎn)錄生長因子超家族，具有廣泛的生物學(xué)活性，參與早期胚胎發(fā)育、軟骨和骨的形成、胞外基質(zhì)的合成、炎癥、間質(zhì)纖維化、免疫和內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)等生理或病理過程，并在腫瘤的形成和發(fā)展起重要作用。TGF－β1對正常細(xì)胞及早期腫瘤的抑制作用是通過調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。研究表明，在許多類型細(xì)胞中，TGF－β家族成員不僅能抑制細(xì)胞增殖，且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在人初乳中TGF－β1濃度的高低決定了母親的哺乳成敗和哺乳持續(xù)時間的長短，可見TGF－β1還與乳腺的發(fā)育、分化及泌乳功能密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一系列基因的激活、表達(dá)、調(diào)控等作用下而采取的主動死亡過程。研究乳腺細(xì)胞凋亡、凋亡發(fā)生機(jī)制的基因調(diào)控將有助于進(jìn)一步探討和揭示乳腺生物學(xué)的基本規(guī)律。TGF－β1是主要的致纖維化細(xì)胞因子，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，TGF－β1可能在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中起到一定的調(diào)控作用。

細(xì)胞接種時要選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，接種量低細(xì)胞間距大，并且代謝物中包含刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)達(dá)不到一定濃度，細(xì)胞生長較慢不易形成單層，接種量高細(xì)胞雖然很快形成單層并達(dá)到一定數(shù)量，但細(xì)胞衰退的速度也相對加快[17]。細(xì)胞傳代培養(yǎng)多根據(jù)細(xì)胞增殖特性選擇合適的細(xì)胞濃度接種。本試驗(yàn)繪制生長曲線檢測細(xì)胞生長狀態(tài)，以傳代培養(yǎng)細(xì)胞濃度5×104個／mL接種細(xì)胞培養(yǎng)板。顯微鏡下觀察正常細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞生長曲線的潛伏期、增殖期、對數(shù)生長期、平臺期界限明顯。結(jié)果顯示細(xì)胞具有較高的增值能力。

MTT法是檢測細(xì)胞增殖的常用方法，原理是根據(jù)活細(xì)胞線粒體中富含琥珀酸脫氫酶，此酶可使MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，形成的含量與細(xì)胞增殖程度呈正相關(guān)[18]。MTT試驗(yàn)1最后OD值要控制在0.75～1.25，這樣才能保證數(shù)據(jù)有線性關(guān)系，以減少試驗(yàn)1誤差，確保試驗(yàn)1的準(zhǔn)確性。以1×104個／mL接種可以產(chǎn)生較好的試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)組奶牛乳腺上皮經(jīng)TGF－β1刺激后，與正常組比較細(xì)胞密度降低，細(xì)胞生長漸慢，MTT法檢測結(jié)果顯示，1、5、10ng／mL TGF－β1試驗(yàn)組與對照組比較，均有抑制乳腺上皮增殖的作用（P＜0.05），不同濃度處理組與時間組間有交互作用（P＞0.05），由此推斷 TGF－β1能調(diào)控抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖過程。有研究表明TGF－β1可作用于腎小管上皮細(xì)胞[19]，引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和增殖能力的下降、腎小管萎縮。TGF－β1是促進(jìn)瘢痕化形成的主要細(xì)胞因子，可以從多個方面促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致瘢痕形成，具有促人Tenon＇s囊成纖維細(xì)胞增殖的作用，TGFvβ1可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖[20]。

分光光度法檢測caspase－3活性和二苯胺反應(yīng)法測定DNA片段化率時以1×106個／mL接種培養(yǎng)板使收集的細(xì)胞數(shù)在105～107范圍內(nèi)，細(xì)胞量在此范圍內(nèi)可保證數(shù)據(jù)的線性關(guān)系。本研究采用caspase－3法和二苯胺反應(yīng)法測定DNA片段化率的方法檢測TGF－β1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡作用。試驗(yàn)組奶牛乳腺上皮經(jīng)TGF－β1刺激后與正常組比較促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞DNA片段化率增加基因組DNA完整性降低。并檢測到TGF－β1濃度增加細(xì)胞基因組DNA片段化率增加，本研究推斷細(xì)胞內(nèi)外過量的TGF－β1可能主要選擇性的誘導(dǎo)了上皮細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂及凋亡。caspase－3法檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度TGF－β1試驗(yàn)組培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞caspase－3的活性隨TGF－β1濃度的增大而平穩(wěn)的增高，呈一定的量效關(guān)系。Caspases是凋亡的執(zhí)行者說明TGF－β1可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡過程。與ailey等的報(bào)道相似TGF－β1作用于小鼠和豬的乳腺上皮細(xì)胞，Bax／Bcl－2比例升高并促進(jìn)線粒體釋放促凋亡因子AIF、細(xì)胞色素C、活性氧及Ca2＋，進(jìn)而活化凋亡執(zhí)行者caspases，后者降解其底物PARP，導(dǎo)致DNA斷裂，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。關(guān)于TGF－β1在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中如何起作用，以及TGF－β1在誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡過程中通過何種通路影響凋亡通路和調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，需要進(jìn)一步研究探討。

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