小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠游泳運(yùn)動(dòng)能力的影響

王 帥，蔣 慧，席琳喬，陳根元，張 玲，馬春暉

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

小花棘豆（Oxytropis glabra）是豆科棘豆屬植物，在新疆分布廣泛，具有一定的藥用價(jià)值，能夠治療關(guān)節(jié)炎、牙痛、神經(jīng)衰弱等，有麻醉、鎮(zhèn)靜、止痛的功效[1]。黃酮類(lèi)化合物是小花棘豆的有效成分之一[2]。于榮敏等[3]分離得到了小花棘豆中的黃酮甙，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，劉璐等[4]比較了5種棘豆屬植物的黃酮類(lèi)物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)小花棘豆的黃酮含量高于急彎棘豆、黃花棘豆和冰川棘豆，具有一定的利用前景。國(guó)內(nèi)外對(duì)小花棘豆的生物堿成分的研究較多，但對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量、組成等研究相對(duì)較少，小花棘豆黃酮類(lèi)物質(zhì)抗脂質(zhì)氧化活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)建立小鼠力竭游泳模型，研究小花棘豆總黃酮的運(yùn)動(dòng)保健和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，為小花棘豆的綜合利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 小花棘豆2011年8月采集于新疆阿拉爾市托喀依鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。取植株的地上部分，陰干、粉碎、過(guò)20目篩后備用。

1.1.2 試劑 超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px），脂褐素（LPO），肌酸激酶（CK），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），過(guò)氧化氫酶（CAT），丙二醛（MDA），肌糖原（Muscle glycogen），肝糖原（liver glycogen），乳酸（lactic acid），尿素氮（BUN）檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.1.3 儀器 VetTest 8008型生化分析儀，StatSpin VT型離心機(jī)，北京安普生化科技有限公司；BS124型精密電子天平，德國(guó)賽多力斯；Direct－Q3型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用6周齡～8周齡昆明種小鼠，體重20g±2g，雌雄各半，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站提供。

1.2 方法

1.2.1 小花棘豆總黃酮的提取 參考劉璐等[4]的方法進(jìn)行。稱(chēng)取小花棘豆樣品100g，加600mL／L乙醇300mL，超聲浸提45min，超聲波功率800W，溫度45℃。過(guò)濾后殘?jiān)偌?00mL／L乙醇300 mL浸提1次，合并濾液，回收乙醇得到總黃酮浸膏，加水稀釋后上處理好的大孔吸附樹(shù)脂，乙醇洗脫。收集洗脫液，揮干后即得到小花棘豆總黃酮樣品。經(jīng) NaNO2－Al（NO3）3－NaOH 顯色方法測(cè)定小花棘豆總黃酮含量為16.54mg／g。該樣品與生理鹽水混勻，用于小鼠灌胃。

1.2.2 小鼠游泳訓(xùn)練 小鼠游泳訓(xùn)練在特制的游泳箱（半徑為50cm，水深為50cm）中進(jìn)行，水溫保持在37℃±1℃。第1天訓(xùn)練時(shí)間為15min，以后逐日遞增5min，加至30min維持該訓(xùn)練量至訓(xùn)練結(jié)束[5]。共訓(xùn)練14d，剔除不會(huì)游泳的小鼠。

1.2.3 小鼠分組與給藥 選取訓(xùn)練合格的40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）和黃酮低劑量組（B組，劑量10mg／kg）、中劑量組（C組，劑量30mg／kg）、高劑量組（D組，劑量50mg／kg），每組10只。對(duì)照組灌服生理鹽水，各試驗(yàn)組連續(xù)灌服15d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn) 末次給藥后1h，在小鼠尾部縛其體重5%的砝碼，放入游泳箱中進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)。記錄從開(kāi)始游泳到力竭（沉入箱底后10s不浮出水面）所用的時(shí)間。力竭后將小鼠取出，采血制備抗凝全血及血清，即刻采用頸椎脫臼法致小鼠死亡，迅速取出小鼠的肝組織制備成100g／L的組織勻漿，取腦組織制備組織勻漿，取小鼠趾長(zhǎng)伸肌。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo) 血液成分采用生化儀測(cè)定13項(xiàng)生理指標(biāo)：白細(xì)胞總數(shù)（WBC），紅細(xì)胞數(shù)（RBC），淋巴細(xì)胞數(shù)（Lym），中值細(xì)胞數(shù)（Mid），粒細(xì)胞數(shù)（Gran），淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Lym%），中值細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Mid%），粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Gran%），血紅蛋白濃度（HGB），紅細(xì)胞壓積 （HCT），平均紅細(xì)胞體積（MCV），平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC），紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）。血清指標(biāo)和組織指標(biāo)均采用試劑盒測(cè)定，血清指標(biāo)包括AST、ALT、CK、SOD、MDA、CAT、GSH－Px、乳酸和BUN；組織指標(biāo)包括SOD、MDA、CAT、GSH－Px和肝糖原（肝臟組織），LPO（腦組織），肌糖原（趾長(zhǎng)伸?。?/p>

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5中One－Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

由表1可知，與對(duì)照組相比，用小花棘豆總黃酮灌胃15d后高劑量組可極顯著延長(zhǎng)小鼠游泳至力竭所需時(shí)間（P＜0.01），中劑量組可顯著延長(zhǎng)小鼠游泳至力竭所需時(shí)間（P＜0.05）。

表1 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table1 Effects of total flavonoids fromOxytropis glabra on weight－loaded swimming time in mice

2.2 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠白細(xì)胞的影響

由表2可知，高劑量組小鼠Mid%和Gran均極顯著高于對(duì)照組，WBC和Gran%極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；中劑量組和低劑量組小鼠 Mid%均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他白細(xì)胞成分與對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。

表2 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠白細(xì)胞的影響Table2 Effects of total flavonoids fromOxytropis glabra on leukocytes in mice

2.3 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白的影響

由表3可知，中劑量組和高劑量組小鼠HGB和HCT均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），高劑量組小鼠MCV和MCHC顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），RBC和RDW與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；低劑量組小鼠所有指標(biāo)與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白的影響Table3 Effects of total flavonoids fromOxytropis glabra on red blood cell and hemoglobin in mice

2.4 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響

由表4可知，使用小花棘豆總黃酮灌胃15d后，高劑量組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后血清SOD、GSH－Px和CAT活性均極顯著高于對(duì)照組，而AST和CK活性及MDA、乳酸和BUN含量均極顯著下降（P＜0.01）。中劑量組小鼠SOD和CAT活性顯著高于對(duì)照組，而MDA和BUN含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。低劑量組小鼠血清MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其他各項(xiàng)指標(biāo)均差異不顯著（P＞0.05）。

表4 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響Table4 Effects of total flavonoids fromOxytropis glabra on serum indexes in mice

2.5 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠組織指標(biāo)的影響

由表5可知，高劑量組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)后肝組織中SOD和GSH－Px活性及肝糖原含量均極顯著高于對(duì)照組，肝組織中MDA含量和腦組織中LPO含量均極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；肝組織CAT活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。中劑量組腦組織LPO含量極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），肝組織中SOD活性和肝糖原含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。低劑量組小鼠肝糖原含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他各項(xiàng)指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。

表5 小花棘豆總黃酮對(duì)小鼠組織指標(biāo)的影響Table5 Effects of total flavonoids fromOxytropis glabra on tissue indexes in mice

3 討論

大量研究結(jié)果表明，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著提高機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平[6]。其原因?yàn)闄C(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉所需的能量為有氧和無(wú)氧作用混合供能，既要求供能快，又要求供能的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，而且整個(gè)過(guò)程缺氧程度較深。故高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后機(jī)體產(chǎn)生了大量的氧自由基（·O2）和中間代謝產(chǎn)物，自由基將不飽和脂肪酸氧化生成脂質(zhì)過(guò)氧化物，最終轉(zhuǎn)變?yōu)镸DA，所以體內(nèi)MDA含量的高低可直接反應(yīng)機(jī)體組織細(xì)胞受損傷的程度[7]；乳酸、尿素氮等代謝產(chǎn)物造成內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)，從而引起機(jī)體疲勞[8]。正常動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在著許多清除自由基的物質(zhì)，其中SOD可將·O2轉(zhuǎn)化為H2O2，再經(jīng)CAT作用分解為O2和H2O；GSH－Px在H2O2的轉(zhuǎn)化過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞和生物大分子免受自由基的破壞。降低機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度又可以減少機(jī)體的無(wú)氧供能，從而減少中間代謝產(chǎn)物，延緩疲勞發(fā)生。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量的小花棘豆黃酮可以極顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳的時(shí)間，說(shuō)明小花棘豆黃酮可以有效減輕長(zhǎng)時(shí)間游泳運(yùn)動(dòng)引起的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。有研究表明，抗氧化劑可以減少·O2對(duì)細(xì)胞器的傷害，減輕細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[9]。黃酮類(lèi)物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗·O2活性，可以有效清除·O2，從而提高小鼠的游泳運(yùn)動(dòng)能力。而小花棘豆黃酮類(lèi)物質(zhì)在體內(nèi)是減少·O2的生成還是加快其清除速率，有待進(jìn)一步探討。

小花棘豆總黃酮可降低血液中WBC和Gran%，提高 Gran、Mid%、Lym% 、HGB、HCT等指標(biāo)；降低了血清中AST和CK的活性，增強(qiáng)了血清和組織中的SOD、CAT和GSH－Px的活性。其中AST在血清中含量較低，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生壞死或破裂時(shí)血清AST活性顯著升高[10]，試驗(yàn)中黃酮灌服組血清AST活性均低于對(duì)照組，說(shuō)明小花棘豆總黃酮可以有效保護(hù)肝細(xì)胞免受·O2的損害。SOD、CAT和GSH－Px均在·O2的清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用，試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)隨著小花棘豆總黃酮灌服劑量的增加，三種酶活性呈上升趨勢(shì)，表明小花棘豆總黃酮能顯著提高小鼠抗力竭運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致?lián)p傷的能力。

在小鼠游泳運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，當(dāng)機(jī)體有氧氧化不能滿(mǎn)足能量的要求時(shí)，就必須靠加速糖的無(wú)氧酵解來(lái)提供能量，在這一過(guò)程中機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸并最終進(jìn)入血液；而當(dāng)機(jī)體可利用的糖耗竭或糖代謝不能提供足夠的能量時(shí)，機(jī)體的蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝會(huì)隨之增強(qiáng)，使得血清中BUN含量增加[11]。小花棘豆總黃酮有效降低了游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠血清乳酸和BUN的含量，可能與其減少了細(xì)胞膜通透性和葡萄糖無(wú)氧酵解，保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)膜以及腎線(xiàn)粒體[12]，改善了小鼠有氧供能的能力從而提高機(jī)體的耐力有關(guān)。

游泳運(yùn)動(dòng)初期，機(jī)體首先利用血中葡萄糖的有氧氧化和肌糖原酵解供給能量，而當(dāng)肌糖原被分解耗竭時(shí)，肝糖原分解增加以維持血糖水平，故肝糖原和肌糖原含量是反映疲勞程度的敏感指標(biāo)[13]。試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量的小花棘豆總黃酮可有效提高游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠肌糖原和肝糖原含量，但總黃酮低劑量組與對(duì)照組差異不顯著。小花棘豆總黃酮是通過(guò)增加肝、肌糖原儲(chǔ)備，還是減少運(yùn)動(dòng)時(shí)對(duì)肝、肌糖原的消耗來(lái)發(fā)揮作用，或者兩者兼有之，仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，小花棘豆總黃酮可明顯提高小鼠游泳運(yùn)動(dòng)能力，增強(qiáng)血清和組織中抗脂質(zhì)過(guò)氧化酶的活性，降低代謝中間產(chǎn)物和MDA的含量，有較好的體內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性，具有一定的應(yīng)用前景。

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