3株雞大腸埃希菌地方分離株I型菌毛的免疫原性

王 東，王旭青，王建波，蒲建明，丁林軍，劉軍紅，張燕飛，殷 東，馬全鑫，扈登強(qiáng)

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750021；2.寧夏大學(xué)外國語學(xué)院2009級英語師范專業(yè)，寧夏銀川750021；3.銀川市農(nóng)業(yè)局，寧夏銀川750001；4.吳忠市畜牧局，寧夏吳忠751100；5.寧夏博奧藥業(yè)有限公司，寧夏銀川750021）

大腸桿菌病是雞的主要傳染病之一，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前雞大腸桿菌病的主要防治手段為藥物防治和免疫接種。藥物防治雖然有一定的防治效果，但長期使用會產(chǎn)生耐藥菌株并導(dǎo)致家禽產(chǎn)品中出現(xiàn)藥物殘留；免疫接種主要使用菌體滅活疫苗，對相同血清型雞大腸埃希菌所致疾病效果良好，但由于大腸埃希菌的血清型眾多，不同地區(qū)不同雞場的優(yōu)勢血清型不盡相同［1-3］，因而菌體滅活疫苗的通用性較差。國內(nèi)外已有研究報道，從致病性大腸埃希菌中提取的I型菌毛具有良好的免疫原性，能抵抗同源菌株的攻擊［4-6］。本研究提取寧夏地區(qū)雞大腸埃希菌3種優(yōu)勢血清型O15、O78、O18菌株的I型菌毛，分別制成菌毛亞單位疫苗，免疫接種雛雞，通過攻毒試驗(yàn)和抗體水平檢測，評價天然I型菌毛亞單位疫苗的免疫效果，為研制雞大腸埃希菌新型疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 3 株雞大腸埃希菌 ZW2（O15）、LXY1（O78）、FWM1（O18），均為寧夏地區(qū)優(yōu)勢血清型菌株，由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從寧夏地區(qū)發(fā)病雞場分離并鑒定。

1.1.2 試驗(yàn)用動物 1日齡海塞克斯雛雞，購于銀川市某種雞場。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白、HRP標(biāo)記兔抗雞IgG為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 取雞大腸埃希菌 ZW2（O15）、LXY1（O78）、FWM1（O18）菌株，分別接種麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20h后，挑取典型菌落接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)72h，收集菌液備用。

1.2.2 菌毛提取 將收集的菌液4 000r／min離心20min，PBS懸浮沉淀，置60℃水浴作用30min，室溫磁力攪拌30min，8 000r／min離心20min，收集上清液，加飽和硫酸銨溶液，4℃過夜；14 000r／min離心20min，PBS懸浮沉淀，放透析袋中4℃透析；將透析液10 000r／min離心20min，取上清液保存?zhèn)溆?。采用紫外分光光度法測定菌毛蛋白濃度，電鏡觀察和SDS-PAGE鑒定菌毛［7-8］。

1.2.3 亞單位疫苗制備 用PBS將菌毛蛋白濃度調(diào)整為600μg／mL，按1∶1的比例與弗氏佐劑混合，按常規(guī)方法乳化成弗氏佐劑疫苗，4℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.4 無菌檢驗(yàn) 將制備的亞單位疫苗分別接種普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h～48h，觀察是否有細(xì)菌生長。

1.2.5 安全性試驗(yàn) 將制備的亞單位疫苗皮下注射7日齡雛雞10只，2.0mL／只，觀察10d，記錄試驗(yàn)雞精神、運(yùn)動和食欲等生理活動是否正常。

1.2.6 動物免疫 1日齡雛雞隔離飼養(yǎng)至7日齡時，分為13組，每組10只。1、5、9組免疫O15菌毛疫苗；2、6、10組免疫 O78菌毛疫苗；3、7、11組免疫 O18菌毛疫苗；4、8、12組為攻毒對照組；13組為陰性對照組。首次免疫使用弗氏完全佐劑疫苗，免疫劑量為0.5mL／只，皮下注射。首次免疫后間隔7d，進(jìn)行第二次免疫，使用弗氏不完全佐劑疫苗，免疫劑量與首次免疫相同。

1.2.7 攻毒試驗(yàn) 第二次免疫后間隔14d，用雞大腸埃希菌普通肉湯24h培養(yǎng)物進(jìn)行攻毒，攻毒途徑為肌肉注射。1組～4組接種O15菌液，攻毒劑量5.7×109cfu／只；5組～8組接種O78菌液，攻毒劑量6.4×109cfu／只；9組～12組接種 O18菌液，攻毒劑量7.2×109cfu／只。攻毒后，觀察各組試驗(yàn)雞發(fā)病與死亡情況。攻毒后第7d，撲殺所有存活試驗(yàn)雞，觀察試驗(yàn)雞肝臟、心包及氣囊的病變。根據(jù)病變程度，分為0～4級。0級：沒有病變；1級：氣囊、心包渾濁，輕度肝周炎；2級：漿液性氣囊炎、心包炎，中度肝周炎；3級：纖維素性氣囊炎、心包炎、肝周炎；4級：嚴(yán)重的纖維素性氣囊炎、心包炎、肝周炎［10-11］。

1.2.8 抗體測定 試驗(yàn)雞在7、14、21、28日齡時翅靜脈采血，每組5只，每只1mL，分離血清后備用。采用間接ELISA方法檢測雞大腸埃希菌天然I型菌毛亞單位疫苗免疫雞的抗體水平［11］。

2 結(jié)果

2.1 疫苗的無菌檢驗(yàn)結(jié)果

接種疫苗的普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h后，無細(xì)菌生長。

2.2 疫苗的安全性檢驗(yàn)結(jié)果

接種亞單位疫苗的雛雞，觀察10d，精神、運(yùn)動和食欲等生理活動未見異常表現(xiàn)。

2.3 疫苗的攻毒試驗(yàn)結(jié)果

免疫組和陽性對照組分別攻擊3株雞大腸埃希菌強(qiáng)毒菌液后，試驗(yàn)雞陸續(xù)出現(xiàn)死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)有不同程度的心包炎、氣囊炎、肝周炎。攻毒后第7d，撲殺所有存活試驗(yàn)雞，觀察病變等級。天然I型菌毛亞單位疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 天然I型菌毛亞單位疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Immune protection of the subunit vaccine of natural type 1pili of avian E.coli

表2 雞血清ELISA抗體效價測定結(jié)果Table 2 Serum antibody titers of vaccinated chickens detected by ELISA

從表1得知，I型菌毛不僅具有良好的免疫原性，而且具有一定的交叉保護(hù)作用。免疫組雞死亡率為0～70%，攻毒對照組雞死亡率為40%～100%，免疫組雞的死亡率明顯低于未免疫雞；免疫雞用同源菌株攻毒后死亡率為0～10%，用異源菌株菌株攻毒后死亡率為20%～70%，陰性對照組雞死全部存活，說明雞大腸埃希菌I型菌毛同源菌株之間免疫保護(hù)率高于異源菌株，異源菌株之間有一定交叉保護(hù)作用。剖檢攻毒死亡雞和存活雞，觀察病變，免疫組雞病變程度顯著輕于未免疫雞。

2.4 抗體水平測定結(jié)果

試驗(yàn)雞免疫接種天然I型菌毛亞單位疫苗后，在7、14、21、28日齡時采血，采用間接ELISA方法檢測抗體效價（表2）。由表2看出，天然I型菌毛疫苗首次免疫后7d，雛雞血清內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體；隨著免疫次數(shù)的增加和免疫日齡的延長，抗體水平相應(yīng)提高。

3 討論

I型菌毛是禽大腸埃希菌的重要致病因子，在感染過程中，可與禽呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體以一種“鎖-鑰匙”的方式特異性結(jié)合；結(jié)合后的E.coli不易被機(jī)體清除，很容易侵入呼吸道深部增殖，從而在致病過程中發(fā)揮重要作用［12-13］。I型菌毛可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，此抗體與入侵細(xì)菌菌毛結(jié)合，封閉菌毛上受體結(jié)合位點(diǎn)，阻斷感染的第一個環(huán)節(jié)，從而防止禽大腸桿菌病的發(fā)生［14］。因此，將I型菌毛制成亞單位疫苗可以有效防制大腸桿菌病的侵襲。戴鼎震等用含I型菌毛的O1、O78及O88菌株，提取菌毛制備單價菌毛油乳苗，免疫接種1日齡雛雞后經(jīng)氣囊攻毒，免疫雞用同源菌株攻毒后死亡率12.5%，用異源菌株攻毒后死亡率37.5%～62.5%［9］。隋兆峰等［7］提取 O78和O24菌株的菌毛制備單價菌毛油乳苗，接種1日齡雛雞后于4周齡攻毒，同源菌株攻毒后死亡率8.33%～16.67%，用異源菌株攻毒出現(xiàn)8.33%～33.33%的死亡率。本研究選擇寧夏地區(qū)的3個優(yōu)勢血清型O15、O78、O18菌株，大容量培養(yǎng)后提取I型菌毛，制備天然菌毛亞單位油佐劑疫苗。分別于7日齡和14日齡時兩次免疫接種，28日齡時攻毒；采用間接ELISA方法測定免疫雞抗體水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，未免疫雞的死亡率40%～100%，免疫雞用同源菌株攻毒后死亡率0～10%，用異源菌株攻毒后死亡率20%～70%；免疫組雞在肝臟、心包和氣囊的病變程度顯著輕于未免疫雞。上述研究結(jié)果說明，雞大腸埃希菌I型菌毛不但對同源菌株具有良好的免疫原性，而且對異源菌株具有一定的交叉保護(hù)作用。

對疫苗的免疫效果進(jìn)行有效評估是正確衡量免疫原的關(guān)鍵因素之一，對于菌毛亞單位疫苗而言，除了做免疫保護(hù)性試驗(yàn)外，還應(yīng)該從體液免疫方面檢測疫苗的免疫效果。李晉紅等提取O2菌株菌毛后制備蜂膠疫苗，免疫雛雞后采用微量凝集試驗(yàn)檢測抗體消長情況，免疫后2d檢測到抗體，6d抗體達(dá)到較高水平［10］。王輝平等提取O78菌株菌毛后制備油佐劑疫苗，免疫雛雞后采用ELISA方法檢測抗體消長情況，一免后4d后出現(xiàn)抗體，14d后抗體達(dá)較高水平［11］。本研究應(yīng)用提取的菌毛亞單位疫苗免疫接種雛雞，免疫后7、14、21d時分別采血，采用間接ELISA方法檢測抗體水平，試驗(yàn)結(jié)果顯示，首次免疫后7d，雛雞血清內(nèi)出現(xiàn)抗體；免疫后21d時的抗體水平高于14d，免疫后14d時的抗體水平高于7d。上述研究結(jié)果表明，雞大腸埃希菌天然菌毛蛋白能夠刺激雛雞免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，并且抗體水平變化情況符合抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律。

雞大腸埃希菌的菌毛提取方法主要有熱敏法和勻漿法。熱敏法對溫度和加熱時間要求嚴(yán)格，溫度過高以及加熱時間過長都可能導(dǎo)致菌毛變性失活；通常采用60℃加熱20min～30min提取菌毛，能保持菌毛蛋白抗原活性；隋兆峰等采用此方法提取I型菌毛［7］。勻漿法一般要求控制好切割速度和溫度，切割速度過高，可能破壞蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)，而且在切割過程中會產(chǎn)生大量的熱量；切割速度過低，無法使菌毛有效脫落；一般要求冰浴條件下，10 000r／min間歇勻漿10min～20min；戴鼎震等應(yīng)用該方法提取I型菌毛［9］。由于熱敏法提取較勻漿法更為方便，因此，本研究采用熱敏法提取雞大腸埃希菌I型菌毛并獲得成功。

［1］馬興樹，朱美霞，王 斌，等.河北省南部雞肝周炎大腸桿菌的分離及血清型鑒定［J］.中國農(nóng)學(xué)通報2009，25（1）：12-16.

［2］李先磊，呂點(diǎn)點(diǎn)，劉立超，等.湖南省岳陽市雞源性大腸埃希菌血清型鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（26）：12590-12591.

［3］吳華俊，任 文，周梅霞，等.揚(yáng)州地區(qū)雞病原性大腸埃希菌的分離與鑒定［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（15）：306-307.

［4］Gyimah J E，Panigrahy B.Immunogenicity of an oil-emulsifiedEscherichiacoli（serorype O1）pili vaccine in chickens［J］.Avian Dis，1985，29：1078-1083.

［5］甘黎明，蔣加進(jìn)，陳鐘鳴，等.雞大腸桿菌重組1型菌毛疫苗的免疫原性［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（36）：22346-22347.

［6］水小溪，李寒鳴，蔡 樂，等.雞致病性E.coliO24基因工程包涵體疫苗的制備及免疫原性［J］.河北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，34（1）：103-107.

［7］隋兆峰，劉文強(qiáng)，范偉興，等.雞致病性大腸桿菌I型菌毛交叉保護(hù)性研究及其結(jié)構(gòu)基因FimA的序列分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25（6）：440-444.

［8］焦利敏，廖學(xué)品，石 碧.紫外分光光度法下直接測定蛋白質(zhì)溶液的濃度［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2007，19（5）：562-566.

［9］戴鼎震，鄭明球，惲?xí)r鋒.雞大腸桿菌I型菌毛亞單位苗交叉保護(hù)的初步研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，1999，31（5）：1-2.

［10］李晉紅，林維慶，黃淑堅.雞病原性大腸桿菌（O2）亞單位疫苗的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，16（3）：72-78.

［11］王輝平，張中直，甘孟侯.雞病原性大腸桿菌（血清型O78）纖毛亞單位苗免疫原性的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1994，25（2）：174-179.

［12］Beachey E H.Bacterial adherence：Adhesin-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surfaces［J］.Infect Dis，1981，143：325-345.

［13］Vidotto MC，Navarro HR，Gaziri LC.Adherence pili of pathogenic strains of avianEscherichiacoli［J］.Vet Microbio1，1997，59：79-87.

［14］Gyimah J E，Panigrahy B，Williams J D.Immunogenicity of anEscherichiacolimultivalent pilus vaccine in chickens［J］.Avian Dis，1986，30（4）：687-689.