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    空腸彎曲菌的培養(yǎng)及其PCR鑒定研究

    2012-08-14 08:09:16楊勝男鄭增忍張樂萃曲志娜黃秀梅李玉清
    動物醫(yī)學(xué)進展 2012年12期
    關(guān)鍵詞:哥倫比亞空腸瓊脂

    楊勝男,鄭增忍,張樂萃,王 娟,曲志娜,黃秀梅,李玉清

    (1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東青島266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島266032)

    彎曲菌(Campylobacter)是重要的食源性人獸共患病原菌[1],可引起人和動物的各種疾病,如人類發(fā)熱、急性腸炎和格林-巴利綜合征[2-3]。在獸醫(yī)學(xué)上,可引起家畜流產(chǎn)、不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎[4]。家畜和野生鳥類是其常見宿主,人類常因為攝入被污染的食物和飲水而感染[5]。而家禽類尤其是雞源產(chǎn)品更是彎曲菌感染傳播的重要途徑[6]。因此,研究彎曲菌具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[7]。彎曲菌培養(yǎng)條件十分苛刻,25℃不生長,42℃生長較好,微需氧條件,普通培養(yǎng)基上生長不良,生長需要萬古霉素、多黏菌素B等抗菌藥物的血瓊脂培養(yǎng)基[8-9]。而常規(guī)生化鑒定則耗時費力,過程復(fù)雜。本試驗優(yōu)化了彎曲菌的分離培養(yǎng)過程,以利于后續(xù)檢測工作的進行,并建立空腸彎曲菌的PCR檢測鑒定方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株來源 空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33560由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心實驗室提供,大腸埃希菌ATCC25922購自中國獸藥監(jiān)察所,金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213購自中國藥品生物制品檢定所。

    1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 彎曲菌CCDA瓊脂、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)為英國OXOID公司產(chǎn)品;綿羊全血為青島海博生物科技公司產(chǎn)品;TTC瓊脂為北京陸橋生物科技公司產(chǎn)品;2×Taq PCR Master Mix、PCR Marker為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;厭氧罐、微需氧產(chǎn)氣袋為日本MGC公司產(chǎn)品;常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

    1.1.3 樣本采集 采集青島地區(qū)雞盲腸包裝,低溫條件下運送至實驗室。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 用接種環(huán)沾取少量雞盲腸內(nèi)容物,劃線接種到CCDA選擇性培養(yǎng)基上,置于微需氧培養(yǎng)罐內(nèi),42℃培養(yǎng)48h。進行2次傳代培養(yǎng),選取可疑菌落接種于TTC瓊脂平板培養(yǎng),陽性者為紫色菌苔并有光澤,挑取單菌落接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。

    1.2.2 菌株API鑒定 挑選出氧化酶陽性的菌株,用接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上選取純培養(yǎng)物,制成6麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?,根?jù)彎曲菌API鑒定條(API20800)說明進行操作接種并培養(yǎng),判讀培養(yǎng)結(jié)果,查閱API20800鑒定標(biāo)準(zhǔn)進行菌株鑒定。

    1.2.3 PCR方法的建立

    1.2.3.1 PCR引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表和Nielsen等[10-12]報道的序列,針對空腸彎曲菌16 S rRNA基因設(shè)計引物,上游引物為5′-CATCTTCCCTAGTCAAGCCT-3′,下游引物為5′-AAGATATGGCACTAGCAAGAC-3′,擴增產(chǎn)物長度為773bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.2.3.2 模板DNA的提取 用接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上挑取適量的純培養(yǎng)物置于盛有1mL PBS的Eppendorf管中,13 500r/min離心5min,去上清。重復(fù)一次離心步驟后,用200μL TE(Tris-EDTA,10∶1)重懸沉淀,放入100℃沸水中煮沸5min~10min。取出置于冰浴中冷卻5min后,13 500r/min離心3min,取上清液作為PCR模板。

    1.2.3.3 PCR反應(yīng)體系 模板DNA 2μL,上、下游引物(20pmol/μL)各0.5μL,2×TaqGreen Mix 12.5μL,滅菌蒸餾水補足至25μL。PCR循環(huán)參數(shù):94℃ 5min;94℃ 1min,64℃ 1min,72℃1min,2個循環(huán);94℃ 1min,62℃ 1min,72℃ 1 min,2個循環(huán);94℃1min,60℃1min,72℃1min,2個循環(huán);94℃1min,58℃1min,72℃1min,2個循環(huán);94℃1min,56℃1min,72℃1min,2個循環(huán);94℃1min,54℃1min,72℃1min,30個循環(huán);72℃延伸10min。

    1.2.3.4 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定 10g/L瓊脂糖凝膠按3mg/L加溴化乙錠(EB)制膠。取8μL PCR擴增產(chǎn)物加樣。用DNA Marker DL 2 000對照。110V電壓,電泳40min,置于凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析電泳結(jié)果。

    PCR產(chǎn)物的測序鑒定,取PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

    1.2.3.5 特異性試驗 用本試驗建立的PCR方法,對分離獲得的空腸彎曲菌以及空腸彎曲菌ATCC、大腸埃希菌ATCC、金黃色葡萄球菌ATCC等對照菌株提取DNA進行檢測,從而確定其特異性。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

    本試驗根據(jù)情況采用彎曲菌CCDA選擇性培養(yǎng)基、TTC瓊脂和哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基,彎曲菌在血瓊脂培養(yǎng)基上不溶血,在CCDA選擇性培養(yǎng)基上典型菌落形態(tài)為圓形,光滑,灰色,閃金屬光澤,菌落較小且容易連成串珠狀。TTC瓊脂上成紫色發(fā)亮菌落,單菌落較明顯,易于選取進行傳代培養(yǎng)。哥倫比亞血瓊脂上菌落呈淺灰色或黃褐色。

    2.2 PCR方法的特異性

    選用建立的PCR方法可擴增出空腸彎曲菌的特異性片段,而金黃色葡萄球菌ATCC,大腸埃希菌ATCC均不能擴增出特異性片段。通過凝膠成像系統(tǒng)對該特異片段進行遷移率計算,其大小為773bp,與預(yù)期的片段相符(圖1)。

    2.3 方法應(yīng)用

    應(yīng)用上述建立的彎曲菌分離培養(yǎng)及PCR方法,我們從100份新鮮雞盲腸樣品中分離出23株空腸彎曲菌,分離率為23%。

    2.4 PCR方法的驗證

    對PCR鑒定的空腸彎曲菌進行API驗證,其鑒定結(jié)果與PCR結(jié)果一致。證明上述空腸彎曲菌PCR方法可應(yīng)用在臨床菌株分離鑒定工作中。

    圖1 PCR特異性試驗Fig.1 The specificity test of PCR

    3 討論

    盲腸內(nèi)容物初代接種在CCDA選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng),容易生長出連成串珠狀的菌落,對典型單菌落的選取造成干擾,不利于進行傳代培養(yǎng);而在TTC瓊脂上進行生化鑒定,培養(yǎng)后長出的單菌落易于選取,利于純化培養(yǎng)單菌落。結(jié)果表明,經(jīng)過CCDA選擇性培養(yǎng),TTC瓊脂培養(yǎng)后更容易選取典型單菌落,有利于回歸接種CCDA培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基純化菌株。為保存菌種和PCR鑒定提取模板提供有利條件。

    何蕊等[13]應(yīng)用mapA基因和16S基因建立的檢測空腸彎曲菌、彎曲菌的PCR方法,可擴增出589bp的特異性片段和857bp的特異性片段,但部分腸道菌擴增出非特異性片段;娜仁高娃等[14]根據(jù)空腸彎曲菌hipO基因建立的PCR鑒定方法,并非所有空腸彎曲菌都能擴增出149bp特異性片段。本試驗所建立的PCR方法有較強特異性,結(jié)果顯示,空腸彎曲菌擴增出特異性條帶,而其他參考菌株均未擴增出條帶,說明該方法有較強特異性。

    綜上所述,經(jīng)過優(yōu)化的分離培養(yǎng)有利于純化菌株,更有利于PCR鑒定檢測及菌種的長期保存。

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