禽流感病毒RT－LAMP檢測技術(shù)的建立

彭 宜，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，謝麗基，范 晴，羅思思

（廣西獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西南寧530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽流行性感冒的簡稱［1］。根據(jù)AIV表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原性不同，AIV可分為16個HA亞型和10個NA亞型［2－3］。禽流感據(jù)其臨床癥狀又可分為高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Mildly pathogenic avian influenza，MPAI）。HPAI由H5、H7亞型AIV引起，以高發(fā)病率和高病死率為特征。MPAI可由所有的HA亞型（H1－H16）AIV引起，通常引起較溫和的臨床癥狀［4－5］。隨著 H5、H7亞型 HPAI的暴發(fā)，MPAI沒有引起人們足夠的重視，直到1999年香港H9N2亞型禽流感病毒感染人的事件才引起世界對MPAI的關(guān)注。有關(guān)研究還表明1997年香港人源H5N1亞型 AIV 與 A／Teal／HK／W 312／97（H6N1）有7個基因片段高度同源［6－7］。越來越多的研究表明家禽中的低致病性禽流感病毒（MPAIV）可以通過基因重排為感染人類的流感病毒提供基因或直接突破種間屏障感染人［8－12］。禽流感不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重威脅人類健康，因此有必要利用快速簡便特異的檢測技術(shù)加強AIV的病原學(xué)監(jiān)測工作。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是近年來發(fā)展起來的在等溫條件下進(jìn)行的新型核酸擴增反應(yīng)，該技術(shù)具有靈敏、特異、結(jié)果便于觀察等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的檢測［13－19］。本研究設(shè)計了針對AIV M基因的特異性LAMP引物，并優(yōu)化相關(guān)反應(yīng)條件，建立的 AIV 逆轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 （RTLAMP）檢測技術(shù)靈敏、特異，并實現(xiàn)了反應(yīng)結(jié)束即可用肉眼直接對結(jié)果進(jìn)行可視化判定，整個反應(yīng)操作簡便、快速、成本低廉，尤其適合在基層進(jìn)行AI的早期診斷和大規(guī)模篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H1、H3、H4、H6、H9、H11亞型 AIV由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)研究室分離鑒定，其他亞型禽流感病毒RNA為美國康州大學(xué) Mazhar I Khan教授惠贈；新城疫病毒（NDV）F48、傳染性支氣管炎病毒（IBV）M41、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）北京株及雞毒支原體（MG）S6由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)研究室保存提供。

1.1.2 主要試劑 Bst DNA聚合酶（大片段）、Mg－SO4、Betaine為 New England Biolabs公司產(chǎn)品；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、d NTP為MBI公司產(chǎn)品；熒光染料為International Laboratory公司產(chǎn)品；SPF雞胚購自北京梅里亞公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA 及 DNA 的抽提根據(jù) Axy PrepTMBody Fluid Viral DNA／RNA Miniprep Kit（愛思進(jìn)公司）說明書制備樣品DNA／RNA，置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 利用Lasergene軟件對大量不同HA亞型AIV的M基因序列進(jìn)行比對，運用在線軟件Primer Explorer V4在M基因的保守區(qū)設(shè)計3套LAMP引物。每套LAMP引物包括1對外引物、1對內(nèi)引物和1對環(huán)引物，其中F3和B3為外引物，F(xiàn)IP（F1c＋F2）和BIP（B1c＋B2）為內(nèi)引物，LF和LB為環(huán)引物。引物由廣州Invitrogen公司合成。通過3次以上重復(fù)試驗，確定特異性和敏感性最好的一套引物（表1）。

表1 RT－LAMP引物序列Table1 Sequences of RT－LAMP primers

1.2.3 RT－LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化 將影響RTLAMP擴增效率的反應(yīng)成分包括MgSO4、Betaine、Bst DNA Po Lymerase、d NTP和反應(yīng)條件（時間、溫度）在如下濃度和條件范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化：MgSO4（0.6、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mmol／L），Betaine（0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.9 mmol／L），Bst DNA Po L－ymerase（4 、5 、6 、7 、8、9 、10 、12、14U），d NTP（0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6 mmol／L）。將溫度按59、60、61、62、63、64℃依次遞增，反應(yīng)時間為30、45、60 min。多次重復(fù)試驗后確定最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)試劑的最佳濃度。

1.2.4 靈敏度試驗 使用 Beckman DU－800紫外分光光度計測定總RNA含量，制備含量分別為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg的禽流感病毒總RNA模板，對各含量禽流感病毒總RNA用RT－LAMP方法和一步RT－PCR方法同時進(jìn)行擴增，RT－PCR擴增引物為F3和B3，RT－LAMP反應(yīng)產(chǎn)物直接可視化觀察，RT－PCR擴增產(chǎn)物10 g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.5 特異性試驗 以不同亞型AIV及NDV、IBV、ILTV、MG核酸為待檢樣品利用優(yōu)化好的RT－LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，對RT－LAMP方法的特異性進(jìn)行檢驗。

1.2.6 RT－LAMP反應(yīng)結(jié)果的觀察 RT－LAMP反應(yīng)之前將熒光試劑（Calcein和MnCl2的混合液）加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)結(jié)束后可在可見光或紫外線下根據(jù)反應(yīng)液的顏色變化用肉眼對結(jié)果直接進(jìn)行判定。也可取5μL產(chǎn)物經(jīng)15 g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.7 臨床樣品的檢測 應(yīng)用建立的 AIV－RTLAMP方法對活禽市場家禽泄殖腔棉拭子樣品及感染雞、健康雞臟器組織研磨混合液共計200份樣品進(jìn)行檢測，所有樣品同時用經(jīng)典的雞胚接種病毒分離方法、傳統(tǒng)的RT－PCR方法進(jìn)行檢測，檢驗AIV－RT－LAMP方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 RT－LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化和結(jié)果觀察

RT－LAMP反應(yīng)總體系為25μL，優(yōu)化后的反應(yīng)體系詳見表2。在63℃水浴鍋或金屬恒溫槽中，反應(yīng)45 min，80℃作用5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)15 g／L瓊脂糖凝膠電泳后，陽性產(chǎn)物可出現(xiàn)LAMP反應(yīng)所特有的特征性條帶（圖1）。同時反應(yīng)結(jié)束后，不需打開反應(yīng)蓋，即可直接可見陽性反應(yīng)液顏色由反應(yīng)前的淺桔色變?yōu)闇\綠色、紫外光下可發(fā)綠色熒光（圖2 A和圖2 B）。

表2 RT－LAMP反應(yīng)體系Table2 The reaction system of RT－LAMP assay

2.2 特異性試驗結(jié)果

如表3所示，建立的RT－LAMP方法能特異性的檢測所有亞型AIV，而對其他呼吸道病原體呈陰性反應(yīng)。

2.3 靈敏度檢驗

如圖2所示 RT－LAMP方法對禽流感病毒RNA的最小檢測限為10 fg，靈敏度是RT－PCR的1 000倍。

2.4 臨床樣品檢測

如表4所示，200份臨床樣品用RT－LAMP方法檢測到23份AIV，結(jié)果與病毒分離結(jié)果相符，而常規(guī)RT－PCR方法漏檢了2份棉拭子樣品。

圖1 RT－LAMP反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1 Products of RT－LAMP assay confirmed by agarose gel electrophoresis

圖2 RT－LAMP和RT－PCR檢測AIV的靈敏度比較Fig.2 Comparative sensitivity tests between RT－LAMP and RT－PCR assays for detection of AIV

表3 RT－LAMP特異性檢測結(jié)果Table3 Specificity results of RT－LAMP assay

表4 臨床樣品檢測結(jié)果Table4 Detection results of clinic samples by virus isolation，RT－PCR，RT－LAMP

3 討論

AIV為RNA病毒，由于RNA依賴的RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒的突變率比DNA病毒高，在宿主防御機制選擇壓力下，AIV的表面抗原基因發(fā)生點突變而引起抗原漂移［20］，另外AIV有多種亞型，且基因組為分8個節(jié)段，當(dāng)不同亞型AIV感染同一細(xì)胞時，病毒基因組可通過互換基因發(fā)生基因重排而引起抗原轉(zhuǎn)變［21］。水禽是AIV的儲存庫，眾多亞型AIV都能從水禽體內(nèi)分離到，且同時感染不同亞型AIV的現(xiàn)象比較普遍，這就為基因重排創(chuàng)造了有利條件，易于產(chǎn)生引起人類流感大流行的新流行株，可見加強AIV監(jiān)測的重要性。近年來時有發(fā)生AIV跨越宿主屏障直接感染人并引起人死亡的事件，提示禽流感不再只是養(yǎng)殖業(yè)的威脅，更嚴(yán)重威脅到人類的健康，發(fā)展快速、準(zhǔn)確的AIV檢測技術(shù)對禽流感及人禽流感防控尤為重要。

LAMP反應(yīng)是通過一套識別靶序列上8個特異區(qū)域的引物和具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下迅速進(jìn)行的核酸擴增反應(yīng)，整個反應(yīng)不需要特殊的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中30 min～60 min即可完成［22］。本研究通過比較基因庫里大量AIV－M基因序列，設(shè)計了多套特異的LAMP引物，通過多次重復(fù)試驗，篩選出一套特異性和敏感性最好的LAMP引物，并優(yōu)化反應(yīng)條件和體系，建立的RT－LAMP技術(shù)能特異的檢測所有亞型AIV而對其他家禽呼吸道病原微生物呈陰性反應(yīng)，靈敏度是常規(guī)RT－PCR方法的1 000倍，臨床樣品的檢出率與經(jīng)典的雞胚病毒分離方法相符。本研究還在反應(yīng)之前加入熒光試劑（Calcein和MnCl2的混合液），反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼在可見光或紫外線下直接觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定結(jié)果［23］，既避免了因反應(yīng)結(jié)束后開蓋加熒光染料時污染環(huán)境而造成假陽性結(jié)果的發(fā)生，同時又實現(xiàn)了反應(yīng)結(jié)果的可視化觀察。

本研究建立的AIV RT－LAMP可視化檢測技術(shù)快速、簡便、靈敏、特異且成本低廉，尤其適合在儀器設(shè)備簡單、技術(shù)人員缺乏的基層用該技術(shù)進(jìn)行禽流感的早期快速診斷和篩查。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：74－78.

［2］Webster R G，Bean W J，Gorman O T，et al.Evolution and ecology of influenza A viruses［J］.Microbiol Rev，1992，56：152－179.

［3］Fouchier A M，Munster V，Wallensten A，et al.Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype（H16）obtained from black－h(huán)eaded gulls［J］.J Virol，2005，79（5）：2814－2822.

［4］Alexander D J.A review of avian influenza in different bird species［J］.Vet Microbiol，2000，74（1－2）：3－13.

［5］Edwards S.OIE laboratory standards for avian influenza［J］.Dev Bio，2006，124：159－162.

［6］Shortridge K F，Zhou N N，Guan Y，et al.Characterization of avian H5N1 influenza viruses from poultry in Hong Kong［J］.Virology，1998，252：331－342.

［7］Peiris M，Yuen K Y，Leung C W，et al.Human infection with influenza H9N2［J］.Lancet，1999，354：916－917.

［8］Crosby A W.America’s forgotten pandemic：the influenza of 1918［M］.Cambridge University Press，Cambridge，United Kingdom，1989.

［9］Kawaoka Y，Krauss S，Webster R G.Avian－to－h(huán)uman transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics［J］.J Virol，1989，63：4603－4608.

［10］Cockburn W C，Delon P J，F(xiàn)erreira W.Origin and progress of the 1968－1969 Hong Kong influenza epidemic［R］.Bull W H O，1969，41：345－353.

［11］Dawood F S，Jain S，F(xiàn)inelli L，et al.Emergence of a novel swine－origin influenza a（H1N1）virus in humans［J］.N Engl J Med，2009，360（25）：2605－2616.

［12］Liu S，Ji K，Chen J，et al.Panorama phylogenetic diversity and distribution of type A influenza virus［J］.PLoS ONE，2009，4：e5022.

［13］Curtis K A，Rudolph D L，Owen S M.Rapid detection of HIV－1 by reverse－transcription loop－mediated isothermal amplification（RT－LAMP）［J］.J Viol Meth，2008，151（2）：264－270.

［14］Pham H M，Nakajima C，Ohashi K，et al.Loop－mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus［J］.J Clin Microbiol，2005，43（4）：1646－1650.

［15］Xu J T，Zhang Z M，Yin Y B，et al.Development of reversetranscription loop－mediated isothermal amplification for the detection of infectious bursal disease virus［J］.J Virol Meth，2009，162：267－271.

［16］Poon L L M，Leung C S W，Chan K H，et al.Detection of human influenza a viruses by loop－mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2005，43（1）：427－430.

［17］Yamazaki W，Taquchi M，Ishibashi M，et al.Development of a loop－mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of campylobacter fetus［J］.Vet Microbiol，2009，136（3／4）：393－396.

［18］Hong T C，Mai Q L，Cuong D V.Development and evaluation of a novel loop－mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus［J］.J Clin Microbiol，2004，42：1956－1961.

［19］Peng Y，Xie Z X，Liu J B，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop－mediated isothermal amplification assay［J］.Virol J，2011，8：337.

［20］Hinshaw V S，Bean W J，Webster R G，et al.Genetic reassortment of influenza A viruses in the intestinal tract of ducks［J］.Virology，1980，102（2）：412－419.

［21］Webster R G，Laver W G，Air G M，et al.Molecular mechanisms of variation in influenza viruses［J］.Nature，1982，296（5853）：115－121.

［22］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：e63.

［23］Tomita N，Mori Y，Kanda H，et al.Loop－mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products［J］.Nature Protocal，2008，3（5）：877－882.