吡咯烷二硫代氨基甲酸對食管癌細胞系EC1增殖、凋亡及細胞周期的影響*

常凱杰，田 芳，閆 苒，劉 彤，黃幼田，鄭曉楓，趙繼敏，江亞南#

1)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院臨床醫(yī)學系鄭州450001 2)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室鄭州450001

食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%。核因子 κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫應答、炎性反應、細胞凋亡以及腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程中的基因調(diào)控［1］。食管癌細胞系 EC1細胞中 NF-κBp65、NF-κBp50 蛋白表達陽性［2］，提示NF-κB基因可能參與了食管的癌變過程。抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是 NF-κB 的特異性抑制劑。目前，關(guān)于PDTC對食管癌細胞系影響的研究國內(nèi)外未見報道。作者擬觀察PDTC對食管癌細胞系EC1細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，探討PDTC用于輔助治療，進而提高食管癌療效的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 小牛血清購自天津 TBD公司，RPMI 1640培養(yǎng)粉購自美國Gibco公司，MTT、二甲基亞砜(DMSO)及碘化吡啶(PI)均購自美國Sigma公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自寶賽生物公司，細胞周期檢測試劑盒購自美國BD公司。EC1細胞系由香港大學曹世華教授惠贈。

1.2 細胞培養(yǎng) EC1細胞在含有體積分數(shù)10%的胎牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、體積分數(shù)為5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.2 g/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L胰蛋白酶混合液消化、傳代，備用。

1.3 PDTC對EC1細胞增殖影響的觀察 取處于對數(shù)生長期的EC1細胞，調(diào)整細胞濃度為4×107L－1，接種于 96 孔板。分別加入 1、5、10、50 和 100 μmol/L的 PDTC 作用 24、48、72 h后(均設 5個復孔)，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在酶標儀上以未加藥的空白對照孔調(diào)零，490 nm處讀取吸光度(A)值。細胞增殖抑制率=(1－實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

1.4 PDTC對EC1細胞凋亡影響的觀察 取2×104個EC1細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶，分別用0、5、10、50和100 μmol/L的PDTC作用48 h后收集細胞，PBS液洗滌2遍，再用體積分數(shù)70%乙醇固定，4℃過夜，用AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒檢測，行PI(50 mg/L)和V雙染色，上流式細胞儀分析亞二倍體峰，分析細胞凋亡率。

1.5 PDTC對EC1細胞周期影響的觀察 分別用0、5、10、50 和100 μmol/L 的PDTC 作用于EC1 細胞48 h后收集細胞，胰蛋白酶消化，離心，棄上清;PBS清洗，離心，棄上清，冰乙醇固定，4℃過夜。檢測前，離心，棄乙醇，PBS洗2遍;加入1 mL PBS制成細胞懸液，加RNaseA(終質(zhì)量濃度50 mg/L)，室溫放置1 h，加1 mL PI(50 mg/L)，避光30 min，按試劑盒說明操作，上流式細胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理。應用3×5析因設計的方差分析比較不同劑量PDTC作用不同時間后EC1細胞的增殖抑制率，應用單因素方差分析比較不同劑量PDTC作用48 h后EC1細胞的凋亡率和細胞周期的差異，檢驗水準α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量PDTC作用不同時間后EC1細胞增殖抑制率測定結(jié)果 見表1。

表1 不同劑量PDTC作用不同時間后EC1細胞增殖抑制率測定結(jié)果(n=5)%

2.2 不同劑量PDTC作用48 h后EC1細胞凋亡率和細胞周期測定結(jié)果 見表2。不同劑量PDTC作用48 h后，隨著PDTC劑量的增加，細胞凋亡率增高，G0/G1期細胞減少，G2/M和S期細胞增多。

表2 不同劑量PDTC作用48 h后EC1細胞的凋亡率和細胞周期(n=5)%

3 討論

越來越多的資料［3-4］表明，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與細胞增殖和凋亡、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移以及腫瘤耐藥關(guān)系密切。PDTC是NF-κB的特異性抑制劑。PDTC最初因其有金屬離子螯合作用而主要用來治療金屬中毒，后來又作為免疫增強劑用于治療獲得性免疫缺陷綜合征，此類藥物可安全應用于人類［5-6］。有研究［7］證實 NF-κBp50 mRNA 在正常組織中未見表達，而食管癌細胞系EC1細胞則出現(xiàn)NF-κBp65、NF-κBp50 mRNA 的表達，提示 NF-κB 基因可能參與了食管癌的癌變過程。有文獻［8-10］報道PDTC可抑制白血病細胞系K562細胞、人肺腺癌A549細胞和胃癌細胞株的增殖。作者發(fā)現(xiàn)，PDTC可劑量依賴性和時間依賴性地抑制食管癌EC1細胞的生長，而抑制最佳時間是48 h。

人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后與細胞凋亡相關(guān)基因的改變密切相關(guān)，誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的重要策略［11］。PDTC可誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡［10］，并可增強卡鉑對 HeLa細胞的促凋亡作用［12］。細胞周期被阻滯于不同的檢查點，意義亦不相同。細胞阻滯在G1期檢查點，可防止DNA受損的細胞進入S期復制;阻滯在S期檢查點，可防止DNA復制不完全的細胞進入G2/M期;阻滯在G2期檢查點，可防止細胞在 M期進行異常分裂［13］。該研究結(jié)果顯示，用不同劑量PDTC作用于EC1細胞48 h，隨著PDTC劑量的增加，EC1細胞凋亡率逐漸增加，S期細胞增多，說明PDTC使EC1細胞大量阻滯在S期，同時提示PDTC可誘導EC1細胞凋亡，為PDTC用于輔助食管癌化療提供了理論依據(jù)。

綜上所述，NF-κB抑制劑PDTC有抑制食管癌EC1細胞生長的作用，并可誘導EC1細胞發(fā)生早期凋亡并將其阻滯在S期，這為食管癌的臨床治療提供了一個新思路。

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