杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及自激活和毒性檢測(cè)*

柴丹丹，李慶華，閻赟夢(mèng)，毛麗紅，李 靚，朱立強(qiáng)，薛樂(lè)勛#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450014

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及自激活和毒性檢測(cè)*

柴丹丹1)，李慶華1)，閻赟夢(mèng)1)，毛麗紅1)，李 靚1)，朱立強(qiáng)2)，薛樂(lè)勛1)#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450014

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

S腺苷高半胱氨酸水解酶;酵母雙雜交;誘餌載體;自激活;杜氏鹽藻

目的:構(gòu)建杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-SAHH，并檢測(cè)其對(duì)酵母細(xì)胞的毒性和自激活作用。方法:應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻的SAHH cDNA，測(cè)序分析后與酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7連接，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法將誘餌載體轉(zhuǎn)入AH109和Y187酵母中，通過(guò)表型篩選檢測(cè)誘餌蛋白對(duì)酵母有無(wú)毒性和自激活作用。結(jié)果:成功構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-SAHH并成功轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109和Y187中，表達(dá)的融合蛋白對(duì)宿主酵母細(xì)胞無(wú)毒性。在AH109和Y187酵母細(xì)胞中誘餌載體均未激活報(bào)告基因HIS3和ADE2，但是激活了報(bào)告基因MEL1。結(jié)論:誘餌載體pGBKT7-SAHH可用酵母雙雜交方法篩選與SAHH相互作用的蛋白。

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700014;科技部國(guó)際科技合作基金資助項(xiàng)目 2007DFA01240

在真核生物中，S腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶催化的甲基化反應(yīng)是最重要的甲基化通路，反應(yīng)生成S腺苷高半胱氨酸(S-adenosyhomocystine，SAH)。S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH hydrolase，SAHH)催化SAH可逆水解生成腺苷和高半胱氨酸(HCys)［1］，此水解過(guò)程是SAH水解的惟一途徑。而HCys可抑制SAH依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，因此SAHH成為SAM依賴性甲基化通路的反饋調(diào)控酶［2］。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶可以從啟動(dòng)子的甲基化、帽子結(jié)構(gòu)的形成、mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯的起始等各個(gè)水平上影響基因表達(dá)的效率［3-5］，所以SAHH作為潛在的抗寄生蟲(chóng)［6］、抗腫瘤［7］和抗艾滋病［8］的藥物靶點(diǎn)而引起廣泛關(guān)注。SAHH還參與其他類型的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)和含硫氨基酸的代謝過(guò)程［9］，但是目前對(duì)SAHH介導(dǎo)的甲基化具體作用機(jī)制以及參與的調(diào)控信號(hào)通路還不盡了解。該實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建鹽藻SAHH酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-SAHH，轉(zhuǎn)化酵母菌株，檢測(cè)其對(duì)酵母菌株有無(wú)毒性作用并進(jìn)行自激活檢測(cè)，為下一步采用酵母雙雜交方法［10］篩選與SAHH相互作用的蛋白提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 杜氏鹽藻UTEX LB-1644購(gòu)自美國(guó)得克薩斯州大學(xué)，大腸桿菌DH5α由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞生物學(xué)室保存;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;AMV cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購(gòu)于大連TaKa-Ra公司;DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Axygen公司;YPD液體和固體培養(yǎng)基以及DO Supplement系列均購(gòu)于上海睿星基因技術(shù)有限公司;X-gal、X-α-gal、DMSO均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;酵母菌株、pGBKT7載體購(gòu)于Clontech公司。

1.2 SAHH cDNA的獲得 根據(jù)pGBKT7載體上的多克隆位點(diǎn)和杜氏鹽藻SAHH cDNA序列設(shè)計(jì)引物［11］，并加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物 S1:5’-CCGGAATTCATGAGTTGACCATCGATG-3’;下游引物 S2:5’-GCGGATCCTTAGTACCTG TAGTGGGCA-3’。杜氏鹽藻總RNA提取方法根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行，然后根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性40 s，63℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)之后72℃延伸10 min;4℃終止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其特異性并進(jìn)行膠回收。

1.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-SAHH的構(gòu)建及鑒定

將PCR產(chǎn)物膠回收的目的片段與pMD18-T載體于16℃連接儀中連接24 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有氨芐青霉素并涂有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選后挑取陽(yáng)性克隆于液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)6～8 h，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行過(guò)夜酶切，鑒定正確后回收目的片段(SAHH片段)，同時(shí)將菌液送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.4 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-SAHH的構(gòu)建及鑒定 將誘餌載體pGBKT7質(zhì)粒同樣用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行過(guò)夜酶切，回收載體片段后與SAHH片段用T4連接酶連接，16℃連接24 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后送公司測(cè)序。

1.5pGBKT7-SAHH的轉(zhuǎn)化

1.5.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 采用Clontech說(shuō)明書上的醋酸鋰法分別制備酵母Y187和AH109的感受態(tài)細(xì)胞。將酵母細(xì)胞在YPDA平板上劃線培養(yǎng)至長(zhǎng)出2 mm克隆后，挑取單克隆至3 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃搖床渦旋(250 r/min)培養(yǎng)8 h后，取5 μL加入到50 mL YPDA培養(yǎng)基中再培養(yǎng)16～20 h，至A(600 nm)值達(dá)0.15～0.30，室溫下2 700 r/min離心5 min棄上清，加60 mL去離子水重懸細(xì)胞，2 700 r/min離心5 min棄上清，用3 mL 1.1×TE/LiAc溶液重懸細(xì)胞，分裝到EP管中，每管1.5 mL，最高轉(zhuǎn)速離心15 s棄上清，用 600 μL 1.1×TE/LiAc溶液重懸，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.5.2 轉(zhuǎn)化及鑒定 在1.5 mL離心管中依次加入500 μL PEG/LiAc溶液、0.5 μL構(gòu)建好的誘餌載體pGBKT-SAHH(500 μg/L)、50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞和5 μL鮭魚(yú)精DNA，渦旋混勻，30℃水浴鍋中培養(yǎng)30 min(每10 min渦旋混勻1次)，每個(gè)離心管中加入20 μL DMSO渦旋混勻，42℃水浴15 min(每5 min渦旋混勻1次)，15 000 r/min離心15 s棄上清，加1 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30℃溫育90 min后，15 000 r/min離心15 s，棄上清，用1 mL NaCl溶液輕輕吹打重懸細(xì)胞，將酵母細(xì)胞懸液涂布SD/-Trp培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～4 d至出現(xiàn)白色菌落。挑取直徑大于2 mm的克隆，劃線SD/-Trp培養(yǎng)基至長(zhǎng)出克隆，保存于4℃冰箱以備酵母雙雜交用。挑取SD/-Trp培養(yǎng)基上的菌落，用引物S1和S2對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行菌落PCR，檢測(cè)誘餌載體是否成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。

1.6 毒性鑒定 將 pGBKT7-SAHH分別轉(zhuǎn)入AH109和Y187酵母細(xì)胞中，涂布SD/-Trp固體培養(yǎng)基，挑取單克隆接種SD/-Trp液體培養(yǎng)基中30℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)其A(600 nm)值。

1.7 自激活檢測(cè) 將誘餌載體pGBKT7-SAHH分別轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109和Y187中，涂布SD/-Trp板，長(zhǎng)出白色菌落后，挑取直徑大于2 mm的單克隆，分別劃線于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp-His/X-α-gal培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d后觀察酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻SAHH cDNA的擴(kuò)增 用引物S1和S2以鹽藻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得約1 500 bp的片段，與預(yù)期大小一致，見(jiàn)圖1。

2.2 誘餌載體pGBKT7-SAHH的鑒定 pMD18-TSAHH雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2，測(cè)序結(jié)果表明產(chǎn)物為SAHH，且與已知序列比對(duì)未發(fā)生突變。誘餌載體pGBKT7-SAHH酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3，測(cè)序結(jié)果表明SAHH片段已按正確的讀碼框插入到pGBKT7載體的多克隆位點(diǎn)中，且序列正確，沒(méi)有發(fā)生有義突變。

2.3 誘餌載體pGBKT7-SAHH的轉(zhuǎn)化 用菌落PCR擴(kuò)增SAHH基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示pGBKT7-SAHH已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，見(jiàn)圖4。

圖4 pGBKT7-SAHH轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞的菌落PCR

2.4 毒性及自激活檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)化誘餌載體的酵母細(xì)胞AH109和Y187的A值均大于0.8。轉(zhuǎn)化了誘餌載體pGBKT7-SAHH的AH109和Y187酵母細(xì)胞在 SD/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)且變藍(lán)(圖5A、5B);在 SD/-Trp-His/X-α-gal培養(yǎng)基上，Y187不能生長(zhǎng)而AH109能生長(zhǎng)且變藍(lán)(圖5C);在SD/-Trp-His/3-AT/X-α-gal培養(yǎng)基上 AH109和Y187都不能生長(zhǎng)(圖5D)。

圖5 轉(zhuǎn)化了pGBKT7-SAHH的AH109和Y187酵母細(xì)胞自激活檢測(cè)結(jié)果

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)作為一種研究蛋白質(zhì)相互作用的有效手段而被普遍應(yīng)用，為研究蛋白質(zhì)之間的相互作用以及研究功能未知蛋白質(zhì)提供了一個(gè)成熟的技術(shù)平臺(tái)［12］。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，酵母細(xì)胞作為真核細(xì)胞為兩個(gè)相互作用的蛋白質(zhì)提供了更接近于天然構(gòu)象和功能的蛋白，但是它還有一個(gè)明顯的缺陷就是假陽(yáng)性問(wèn)題，如果誘餌本身就可以激活下游的報(bào)告基因，就不能作為誘餌來(lái)篩選文庫(kù)中與之相互作用的蛋白，所以自激活實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證誘餌蛋白能否用于酵母雙雜交的必需步驟。

在酵母雙雜交系統(tǒng)中共有3個(gè)報(bào)告基因。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化誘餌載體的酵母細(xì)胞AH109和Y187的A值均大于0.8，說(shuō)明pGBKT7-SAHH對(duì)2種酵母細(xì)胞均無(wú)毒性［11］。以上2種酵母細(xì)胞在SD/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)基上均變藍(lán);在SD/-Trp-His/ X-α-gal培養(yǎng)基上AH109能生長(zhǎng)且變藍(lán)，Y187不能生長(zhǎng)，說(shuō)明了 Y187不能激活報(bào)告基因 His3，而AH109能激活報(bào)告基因His3;當(dāng)在培養(yǎng)基中加入組氨酸競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑3-AT后AH109不能生長(zhǎng)，說(shuō)明在Y187和AH109酵母細(xì)胞中pGBKT7-SAHH表達(dá)的融合蛋白沒(méi)有激活His3和ADE2，但是激活了報(bào)告基因MEL1。結(jié)果表明，構(gòu)建的pGBKT7-SAHH對(duì)報(bào)告基因ADE2和His3沒(méi)有自激活作用，排除了誘餌載體的假陽(yáng)性，為進(jìn)一步利用酵母雙雜交從鹽藻基因的AH109酵母文庫(kù)篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中可以使用ADE2和His3報(bào)告基因來(lái)篩選陽(yáng)性結(jié)果，但這樣可能導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)，因此在實(shí)驗(yàn)中還需要采用免疫共沉淀或Pull-down等蛋白質(zhì)相互作用的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Haba GD，Cantoni GL.The enzymatic synthesis of S-adelosyl-L-homoeysteine from adenosine and homoeysteine［J］.J Biol Chem，1959，234(3):603

［2］Chiang PK.Biological effects of inhibitors of S-adenosylhomocysteine hydrolase［J］.Pharmacol Ther，1998，77(2): 115

［3］Pritchard PH，Chiang PK，Cantoni GL，et al.Inhibition of phosphatidylethanolamine N-methylation by 3-deazaadenosine stimulates synthesis the of phosphatidylcholine via the CDP-eholine pathway［J］.J Biol Chem，1982，257 (11):6362

［4］Boissier F，Bardou F，Guillet V，et al.Further insight into S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases［J］.J Biol Chem，2006，281(7):4434

［5］Wang C，Leffler S，Thompson DH，et al.A general flurescence-based coupled assay for S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases［J］.Biochem Biophys Res Co mmun，2005，331(1):351

［6］Cai SM，Li QS，F(xiàn)ang JW，et al.The rationale for targeting the NAD/NADH cofactor binding site of parasitic S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase for the design of antiparasitic drugs［J］.NucleosidesNucleotides Nucleic Acids，2009，28(5):485

［7］Castro R，Rivera I，Struys EA，et al.Increased homocysteine and S-adenosylhomocysteine concentrations and DNA hypomethylation in vascular disease［J］.Clin Chem，2003，49 (8):1292

［8］Hermes M，Osswald H，Kloor D.Role of S-adenosylhomocysteine hydrolase in adenosine-induced apoptosis in HepG2 cell［J］.Exp Cell Res，2007，313(2):264

［9］Malanovic N，Streith I，Wolinski H，et al.S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，key enzyme of methylation metabolism，regulates phosphatidylcholine synthesis and triacylglycerol homeostasis in yeast:implications for homocysteine as a risk factor of atherosclerosis［J］.J Biol Chem，2008，283(35):23989

［10］Fields S，Song O.A novel genetic system to detect proteinprotein interactions［J］.Nature，1989，340(6230):245

［11］馬生秀，鄧璐霞，羅林，等.防御素HNP-3成熟肽素酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及自激活和毒性檢測(cè)［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2007，20(2):151

［12］閻赟夢(mèng)，李慶華，李杰，等.杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(4):517

Construction of a bait vector for SAHH of Dunaliella salina and evaluation of its self-activation in yeast two-hybrid system

CHAI Dandan1)，LI Qinghua1)，YAN Yunmeng1)，MAO Lihong1)，LI Liang1)，ZHU Liqiang2)，XUE Lexun1)1)Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450014

S-adenosyhomocystine hydrolase;yeast two-hybrid;bait vector;self-activation;Dunaliella salina

Aim:To construct a bait vector for S-adenosyhomocystine hydrolase(SAHH)of Dunaliella salina and to evaluate its self-activation activity and toxic effects in yeast two-hybrid system.Methods:The full-length SAHH gene was amplified by RT-PCR and confirmed by sequencing.A fragment of the gene was then subcloned into the vector SAHH of pGBKT7 to construct the bait vector.The constructed bait vector pGBKT7-SAHH was transformed into yeast strains AH109 and Y187 by PEG/LiAc method and its self-activation was tested by the phenotype assay.Results:The constructed bait vector of pGBKT7-SAHH was successfully transformed into yeast strains Y187 and AH109，and the fusion proteins were not toxic to yeast cells;the reporter genes HIS3 and ADE2 were not self-activated，but MEL1 was self-activated.Conclusion: The pGBKT-SAHH could act as a bait to screen interaction proteins of SAHH in yeast two-hybrid system.

Q782

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.01.006

(2011-03-30收稿 責(zé)任編輯李沛寰)