乙醇對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的影響*

邱寒梅，閆紅濤#，謝增瑞

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州市公安局鄭州 450000

#通訊作者，男，1963年5月生，博士，教授，研究方向:法醫(yī)病理學(xué)，E-mail:yanht678@sina.com

乙醇對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的影響*

邱寒梅1)，閆紅濤1)#，謝增瑞2)

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州市公安局鄭州 450000

#通訊作者，男，1963年5月生，博士，教授，研究方向:法醫(yī)病理學(xué)，E-mail:yanht678@sina.com

乙醇;皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞;CYP2E1;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;神經(jīng)元特異性烯醇化酶;大鼠

目的:觀察乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)的變化。方法:分別采用0.5、1.5和3.0 g/L乙醇作用于原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，對照組細(xì)胞以等量生理鹽水處理。作用30 min和1、2、4、8、12、24 h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE的表達(dá)。結(jié)果:乙醇可以增強(qiáng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS的表達(dá)，降低NSE的表達(dá)，并且對CYP2E1(F劑量=57.123，F(xiàn)時間=12.111，F(xiàn)交互=4.987，P均＜0.001)、iNOS(F劑量=55.081，F(xiàn)時間=10.949，F(xiàn)交互=4.278，P均＜0.001)和NSE(F劑量=69.334，F(xiàn)時間=10.871，F(xiàn)交互=3.252，P均＜0.001)表達(dá)的影響均表現(xiàn)出一定的劑量依賴性和時序性。1.5 g/L乙醇作用2 h時3者表達(dá)開始變化，12 h時作用最強(qiáng);3.0 g/L乙醇作用1 h時3者表達(dá)開始變化，8 h時作用最強(qiáng)。結(jié)論:乙醇能誘導(dǎo)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1和iNOS的表達(dá)，降低NSE的表達(dá);3者表達(dá)的時間變化特點(diǎn)基本一致，3者聯(lián)合檢測可用于推斷乙醇的作用時間。

腦損傷后各種酶、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白等相繼發(fā)生一系列的動態(tài)變化，觀察這些指標(biāo)在腦損傷后的動態(tài)變化，可為早于一般形態(tài)學(xué)變化的早期腦損傷時間的推斷提供參考［1］。乙醇是一種親神經(jīng)物質(zhì)，屬于中樞神經(jīng)抑制劑，有很強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞毒性，但其對神經(jīng)細(xì)胞作用的機(jī)制仍不清楚。多年來，學(xué)者們從生物化學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域研究乙醇對神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腦損傷時神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)的表達(dá)均有明顯改變［2-7］。作者采用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察不同劑量乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的時序性變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級新生SD大鼠，20～30 g，雌雄不拘，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要儀器和試劑 醫(yī)用型潔凈工作臺(SWCJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus)，倒置顯微鏡(日本 Nikon Eclipse TS100)，超速低溫離心機(jī)(德國 Heraeus Biofuge stratos D-37520 Osterale)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus CH-2)，攝影顯微鏡(日本Olympus BX-51)。兔抗大鼠NSE、CYP2E1、iNOS抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，無水乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 參考文獻(xiàn)［8］。取24 h內(nèi)新生SD大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，共培養(yǎng)9 d，采用SP法進(jìn)行NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色。經(jīng)染色鑒定，原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞純度為90%。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)至第9 d，將接種細(xì)胞的培養(yǎng)皿隨機(jī)分為4組，低、中、高劑量乙醇組和對照組。低、中和高劑量乙醇組在培養(yǎng)液中加入無水乙醇，使培養(yǎng)液中乙醇劑量分別為0.5、1.5和3.0 g/L;對照組在培養(yǎng)液中加入等量生理鹽水。分別于作用30 min和1、2、4、8、12和24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，并進(jìn)行CYP2E1、iNOS和NSE檢測。

1.4 原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE的檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色SP法進(jìn)行CYP2E1、iNOS和NSE檢測，按試劑盒說明書操作，一抗按1∶50稀釋，以PBS代替一抗作陰性對照。CYP2E1、iNOS和NSE陽性細(xì)胞均表現(xiàn)為胞質(zhì)及突起呈棕黃色。200倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計算每個視野中陽性細(xì)胞百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。分別以乙醇劑量(4個水平)和作用時間(7個水平)為考察因素，對CYP231、iNOS和NSE陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行4×7析因設(shè)計的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞倒置顯微鏡下的表現(xiàn) 見圖1。低劑量乙醇組各時間點(diǎn)細(xì)胞的形態(tài)與對照組基本相同。中劑量乙醇組作用12 h時，細(xì)胞呈梭形或長梭形，24 h時胞質(zhì)內(nèi)可見圓形空泡。高劑量乙醇組作用1 h時，細(xì)胞腫大變圓，胞質(zhì)內(nèi)可見少量圓形空泡;4 h時胞質(zhì)內(nèi)可見大量圓形空泡，細(xì)胞突起變短明顯;12 h時部分細(xì)胞核腫大，核仁不明顯，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量圓形空泡，突起明顯變短或消失;24 h時，大部分細(xì)胞核腫大或消失，細(xì)胞間連接消失。

圖1 不同劑量乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞倒置顯微鏡下的表現(xiàn)(×400)

2.2 不同劑量乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE的表達(dá) 見圖2和表1～3。從表1～3可以看出，乙醇可劑量依賴性地增強(qiáng)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1和iNOS的表達(dá)，并表現(xiàn)出一定的時序性，低、中、高劑量乙醇分別作用24、12和8 h時，2者表達(dá)達(dá)高峰，之后中、高劑量乙醇組2者的表達(dá)下降;同時乙醇可降低NSE的表達(dá)，并表現(xiàn)出劑量依賴性和時序性。

圖2 不同劑量乙醇作用2 h后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE的表達(dá)(SP，×200)

表1 乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1陽性細(xì)胞百分比測定結(jié)果(n=5) %

表2 乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞iNOS陽性細(xì)胞百分比測定結(jié)果(n=5) %

表3 乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NSE陽性細(xì)胞百分比測定結(jié)果(n=5) %

3 討論

在法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及鑒定中，經(jīng)常遇到乙醇中毒(醉酒)及大量乙醇攝入導(dǎo)致死亡的案例，在不同劑量乙醇作用下機(jī)體有什么改變，特別是腦組織的改變與乙醇劑量和作用時間有什么關(guān)系是法醫(yī)檢驗(yàn)鑒定人員比較關(guān)心的問題。運(yùn)用腦損傷后形態(tài)學(xué)改變來推斷腦損傷時間是最經(jīng)典的方法，但腦損傷后形態(tài)學(xué)的改變往往出現(xiàn)比較晚，可能需要6～12 h或更長時間才有表現(xiàn)，而且各種變化的時相又相互重疊，無明確的時間分界，因而無法用于腦損傷時間的精確推斷。該研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察不同劑量乙醇對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的影響，旨在探討乙醇作用劑量和時間與神經(jīng)細(xì)胞改變的關(guān)系，從而為此類的檢驗(yàn)及鑒定提供理論基礎(chǔ)。

CYP2E1在腦組織中的表達(dá)位于大腦皮質(zhì)、蒲肯野和小腦顆粒細(xì)胞［9］，主要參與乙醇、丙酮、氯仿等小分子化合物的代謝，易為乙醇等小分子化合物誘導(dǎo)。Haorah等［2］研究發(fā)現(xiàn)，乙醇作用后，體外培養(yǎng)的人神經(jīng)元CYP2E1活性顯著上調(diào)。iNOS在大多數(shù)正常細(xì)胞中不存在，但是可被轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導(dǎo)NO的合成。大量NO合成被認(rèn)為是組織損傷的標(biāo)志。Fataccioli等［3］用1.1～4.5 g/L乙醇急性作用于小腦后，發(fā)現(xiàn)腦組織中NOS并未被激活。Davis等［4］發(fā)現(xiàn)用2.2或9.0 g/L乙醇作用于人星形膠質(zhì)細(xì)胞后，iNOS在細(xì)胞內(nèi)的活性沒有變化。但Sinz等［10］運(yùn)用RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，外傷性腦損傷后大鼠腦組織中iNOS mRNA表達(dá)的變化存在一定的時序性。蔡紅星等［5］研究發(fā)現(xiàn)人重度顱腦損傷后，腦組織中iNOS在傷后4～8 h表達(dá)開始升高，傷后1～2 d達(dá)峰值，以后逐漸下降。作者觀察到，0.5 g/L乙醇作用后，原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1的表達(dá)稍有增強(qiáng);而1.5 g/L乙醇作用2 h后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1表達(dá)開始增強(qiáng)，12 h時表達(dá)最強(qiáng)，隨后表達(dá)逐漸下降;3.0 g/L乙醇作用1 h后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1的表達(dá)即開始增強(qiáng)，8 h時表達(dá)最強(qiáng)，隨后表達(dá)逐漸下降。不同劑量乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞iNOS表達(dá)的變化與CYP2E1一致，類似于蔡紅星等［5］的研究結(jié)果。提示乙醇可能通過誘導(dǎo)腦組織CYP2E1和iNOS的表達(dá)，參與腦損傷過程。

NSE是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì)，存在于成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中。Gross等［6］采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的損傷模型，證實(shí)培養(yǎng)液中NSE劑量與細(xì)胞死亡數(shù)量有明顯的定量關(guān)系;大鼠腦損傷后1 h～2 d，腦組織NSE的表達(dá)呈下降趨勢。新生鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血性腦損傷24 h時，損傷部位大腦皮質(zhì)NSE水平顯著降低，7 d后有所升高，但仍低于正常對照組［7］。Hardemark等［11］發(fā)現(xiàn)在大鼠實(shí)驗(yàn)性挫傷模型中，大鼠腦脊液中NSE水平明顯高于對照組，腦脊液中NSE水平的第1個波峰出現(xiàn)在傷后7.5 h，第2個波峰在1.5 d后。閆曉鵬等［12］研究發(fā)現(xiàn)大鼠液壓沖擊性腦損傷后，實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿NSE濃度隨損傷程度增加而增加;重度損傷組血漿NSE濃度于傷后0.5 h即開始明顯增高，并達(dá)到峰值，12 h達(dá)到第2個峰值;中度損傷組血漿NSE濃度于傷后2 h達(dá)到峰值，24 h達(dá)到第2個峰值;輕度損傷組血漿NSE濃度于傷后2 h達(dá)到峰值，48 h達(dá)到第2個峰值;損傷程度越重，血漿NSE濃度高峰出現(xiàn)的越早。作者觀察到，3.0 g/L乙醇作用后，原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞NSE表達(dá)下降較快，1 h時表達(dá)開始下降，8 h時表達(dá)最弱，24 h時仍有少量表達(dá)，說明高劑量乙醇對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷。

不同劑量乙醇作用后原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的時間變化特點(diǎn)說明3種因子可能共同參與了神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程。由于3者的表達(dá)與乙醇劑量及作用時間密切相關(guān)，在法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及鑒定中，3者聯(lián)合檢測可用于推斷乙醇的作用時間。

［1］王慧君，秦啟生.腦損傷時間推斷研究新進(jìn)展［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，1999，14(4):250

［2］Haorah J，Ramirez SH，F(xiàn)loreoni N，et al.Mechanism of alcohol-induced oxidative stress and neuronal injury［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(11):1542

［3］Fataccioli V，Gentil M，Nordmann R，et al.Inactivation of cerebellar nitric oxide synthase by ethanol in vitro［J］.Alcohol Alcohol，1997，32(6):683

［4］Davis RL，Syapin PJ.Acute ethanol exposure modulates expression of inducible nitric-oxide synthase in human astroglia:evidence for a transcriptional mechanism［J］.Alcohol，2004，32(3):195

［5］蔡紅星，李周儒，程言博，等.Caspase3和iNOS在人挫傷腦組織中的時序性表達(dá)［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(4):241

［6］ Gross J，Ungethum U，Andreeva N，et al.Glutamate-induced efflux of protein，neuron-specific enolase and lactate dehydrogenase from a mesencephalic cell culture［J］.Eur J Clin Chem Clin Biochem，1996，34(4):305

［7］夏斌，姚裕家，陳大鵬.新生鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血性腦損傷時大腦皮質(zhì)NSE和GFAP的變化［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2004，25(5):443

［8］Qiu H，Yan H，Tang J，et al.A study on the influence of ethanol over the primary cultured rat cortical neurons by using the scanning electron microscopy［J］.Micron，2011，Spe 8［Epub ahead of print］

［9］Upadhya SC，Tirumalai PS，Boyd MR，et al.Cytochrome P4502E(CYP2E)in brain:constitutive expression，induction by ethanol and localization by fluorescence in situ hybridization［J］.Arch Biochem Biophys，2000，373(1):23

［10］Sinz EH，Kochanek PM，Dixon CE，et al.Inducible nitric oxide synthase is an endogenous neuroproteetant after traumatic brain injury in rats and mice［J］.J Clin Invest，1999，104(5):647

［11］Hardemark H，Ericsson N，Kotwica Z，et al.S-100 protein and neuron-specific enolase in CSF after experimental traumatic or focal ischemic brain damage［J］.J Neurosurg，1989，71(5 Pt1):727

［12］閆曉鵬，劉躍亭，段虎斌，等.大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后血中神經(jīng)元特異性烯醇化酶變化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥物與臨床，2008，8(12):932

Expressions of CYP2E1，iNOS and NSE in primary cultured rat cortical neurons treated with ethanol

QIU Hanmei1)，YAN Hongtao1)，XIE Zengrui2)1)Department of Forensic Medicine，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)Police Bureau of Zhengzhou，Zhengzhou 450000

ethanol;cortical neuron;CYP2E1;inducible nitric oxide synthase;neuron-specific enolase;rat

Aim:To study the changes of CYP2E1，inducible nitric oxide synthase(iNOS)and neuron-specific enolase (NSE)expressions in primary cultured rat cortical neurons treated with ethanol.Methods:Primary cultured rat cortical neurons were treated with 0，0.5，1.5 and 3.0 g/L ethanol for 30 min and 1，2，4，8，12，24 h，respectively，then the expressions of CYP2E1，iNOS and NSE in neurons were detected by immunocystochemical method.Results:Ethanol could increase the expressions of CYP2E1(Fdose=57.123，F(xiàn)time=12.111，F(xiàn)interaction=4.987，P＜0.001)and iNOS(Fdose=55.081，F(xiàn)time=10.949，F(xiàn)interaction=4.278，P＜0.001)，and decrease the expression of NSE(Fdose=69.334，F(xiàn)time=10.871，F(xiàn)interaction=3.252，P＜0.001)in dose-dependent and time-sequential manner.The action of 1.5 g/L ethanol began at 2 h，and reached the peak at 12 h.While the action of 3.0 g/L ethanol began at 1 h，and reached the peak at 8 h.Conclusion:Ethanol could induce the expressions of CYP2E1 and iNOS，meanwhile decrease the expression of NSE in rat cortical neurons.The similar temporal patterns of CYP2E1，iNOS and NSE expressions suggest that combined detection of CYP2E1，iNOS and NSE be helpful for the action time assessment of ethanol in forensic analysis.

DF795.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.01.017

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目 200703001

(2011-05-27收稿 責(zé)任編輯王 曼)