基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫構(gòu)建上的應(yīng)用

李素一

摘要基因捕獲是一種新的基因標(biāo)簽技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于植物突變體庫的構(gòu)建及基因分離。近年來，基因捕獲技術(shù)應(yīng)用于水稻突變體庫構(gòu)建方面取得了顯著進(jìn)展；介紹了基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫構(gòu)建上的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞基因捕獲；報告基因；水稻突變體庫

中圖分類號 Q343.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2009）02-0125-02

水稻是世界上最重要的三大經(jīng)濟作物之一，同時也是生命科學(xué)研究的模式植物，水稻基因組的全序列得到破譯之后，分離和研究水稻中的基因功能成為一項迫切而重要的任務(wù)?；虿东@是一種將帶有報告基因的重組載體隨機整合到基因組中，使插入基因被激活或失活，然后通過檢測報告基因的表達(dá)和利用一些基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)來分離被插入基因的研究基因功能的新方法。目前，它已被廣泛應(yīng)用于植物突變體庫的構(gòu)建和基因分離。近年來，基因捕獲技術(shù)應(yīng)用于水稻突變體庫構(gòu)建方面取得了顯著進(jìn)展，本文介紹了基因捕獲技術(shù)及其在水稻突變體庫構(gòu)建中的應(yīng)用。

1基因捕獲系統(tǒng)的類型

基因捕獲包括3種系統(tǒng)類型：增強子捕獲（enhancer trap）、啟動子捕獲（promoter trap）和基因捕獲（gene trap），而基因捕獲實際上是這3種類型的統(tǒng)稱[1]。

1.1增強子捕獲系統(tǒng)

增強子捕獲系統(tǒng)是將報告基因與一個最小的啟動子相連，組成一個增強子捕獲重組體（見圖1B）。典型的最小啟動子含有TATA box及轉(zhuǎn)錄起始位點，它不能單獨驅(qū)動報告基因的表達(dá)，只有當(dāng)它被插入位點附近的增強子激活時，才可起始轉(zhuǎn)錄而使報告基因表達(dá)。由此可推知插入位點附近有增強子或基因，即實現(xiàn)了以該增強子捕獲系統(tǒng)來發(fā)現(xiàn)增強子的目的。

1.2啟動子捕獲系統(tǒng)

啟動子捕獲系統(tǒng)中，利用一個無啟動子的報告基因，隨機插入在基因組中，當(dāng)報告基因插入到內(nèi)源基因的外顯子中，且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)方向和該基因的閱讀框一致時就會表達(dá)（見圖1C）。通過檢測報告基因是否表達(dá)則可知該報告基因附近是否有啟動子，檢測報告基因在生物體的什么部位表達(dá)即可知被插入基因的表達(dá)是否有特異性，從而起到了以之為誘餌，發(fā)現(xiàn)啟動子的目的。

1.3基因捕獲系統(tǒng)

狹義的基因捕獲載體是指插入到結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部從而捕獲該基因的載體，帶有一個不含啟動子的報告基因，包括內(nèi)含子捕獲載體和外顯子捕獲載體（見圖1D）。前者通常由報告基因和1個或者幾個剪接受體位點（splice acceptor，SA）組成，剪接受體位點在報告基因上游。該重組體如果插入到基因組的內(nèi)含子中，從染色體基因的剪接供體位點到報告基因的剪接受體位點的剪接就會使上游外顯子與報告基因融合，從而使報告基因隨著基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。后者插入在基因的外顯子，因此不需要添加SA位點就可以產(chǎn)生融合mRNA，所以如果能檢測到融合轉(zhuǎn)錄物或融合蛋白，就可以證明插入位置附近有基因存在。

這3種捕獲系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，增強子捕獲不受插入位置的限制，且捕獲頻率往往較高，甚至可高達(dá)60%[2]。但由于增強子與基因的位置可近可遠(yuǎn)，故增強子捕獲不易定位基因。啟動子捕獲系統(tǒng)捕獲的頻率比增強子捕獲系統(tǒng)低，但它產(chǎn)生的突變頻率較高。除轉(zhuǎn)錄融合外，啟動子捕獲和增強子捕獲還能創(chuàng)造翻譯融合，從而為蛋白質(zhì)定位提供信息。

2基因捕獲系統(tǒng)中插入元件的類型

基因捕獲系統(tǒng)中，攜帶報告基因轉(zhuǎn)入到植物基因組中去的插入元件主要有2種：T-DNA和轉(zhuǎn)座子元件，二者各有優(yōu)缺點。

2.1T-DNA

以T-DNA為介導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化已成為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的常用方法。T-DNA標(biāo)簽法是以人工構(gòu)建好的T-DNA為標(biāo)簽，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，將其導(dǎo)入植物基因組中，使插入位點的基因被激活或失活，通過TAIL-PCR或Inverse PCR獲得T-DNA的側(cè)翼序列，進(jìn)而捕獲該基因。由于T-DNA的插入通常是比較穩(wěn)定的，而且沒有位點特異性，所以利用T-DNA標(biāo)簽的優(yōu)點就可以創(chuàng)建飽和的T-DNA插入突變體庫[3，4]。但它的一個不足之處在于T-DNA通常會在單一植株中造成多拷貝插入，可能是單個位點的多拷貝串聯(lián)，也可能是多個位點的T-DNA插入。這會導(dǎo)致對基因捕獲系統(tǒng)中報告基因表達(dá)模式的研究變得復(fù)雜。此外，插入事件中還往往有其他復(fù)雜的現(xiàn)象，比如T- DNA與臨近染色體DNA的重排或者本身的同向或反向串聯(lián)重復(fù)等[5]。這些情況都使被插入基因的分離和分析變得困難。

2.2轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座子也常用來產(chǎn)生插入突變。常見的轉(zhuǎn)座子有玉米的Ac/Ds 和En/Spm轉(zhuǎn)座子，目前只有Ac/Ds系統(tǒng)可用于增強子捕獲和基因捕獲。Ac/Ds因為拷貝數(shù)低而得到廣泛的應(yīng)用，而En/Spm轉(zhuǎn)座子因它的高拷貝數(shù)會導(dǎo)致報告基因表達(dá)的復(fù)雜化，所以較少被利用。

Ac/Ds系統(tǒng)由自主轉(zhuǎn)座元件Ac和非自主轉(zhuǎn)座元件Ds組成。Ac編碼一個轉(zhuǎn)座酶，與Ac和Ds的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列相結(jié)合，催化其向基因組中的其他位置轉(zhuǎn)座。Ds失去轉(zhuǎn)座酶活性，不能編碼轉(zhuǎn)座酶，無法自主轉(zhuǎn)座，但它尚保留末端倒位重復(fù)序列，能被Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶識別，從而催化轉(zhuǎn)座的發(fā)生。利用這種雙元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以產(chǎn)生穩(wěn)定的插入，還可通過有性雜交在轉(zhuǎn)座植株中引入轉(zhuǎn)座酶誘導(dǎo)再次轉(zhuǎn)座，這時產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座可以引起回復(fù)突變，以驗證所分離基因的功能。

3基因捕獲系統(tǒng)中報告基因的類型

3.1β-葡萄糖苷酸酶基因

β-細(xì)菌的葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，gusA）是植物中常用的報告基因。用gus基因作為報告基因的主要優(yōu)點是其產(chǎn)物GUS蛋白相當(dāng)穩(wěn)定，而且與其他蛋白融合后仍能保持生物活性。而GUS蛋白的活性很容易通過組織化學(xué)染色方法被檢測到，這種檢測非常靈敏，甚至能檢測到gus在單細(xì)胞中的表達(dá)。但它的不足之處在于酶促反應(yīng)底物相當(dāng)昂貴，成本高。另外，組織化學(xué)染色會對活體組織造成破壞，因此GUS檢測無法用于活體組織。

3.2綠色熒光蛋白基因

水母的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因也被廣泛應(yīng)用于植物的基因捕獲中。因它的產(chǎn)物可發(fā)出熒光，因而只要有適當(dāng)?shù)墓庠醇纯杀粰z測到，相對經(jīng)濟廉價。此外GFP的檢測不具有破壞性，因而可進(jìn)行活體檢測。但GFP應(yīng)用于植物中也有其限制性，例如GFP的表達(dá)量與植物本身的生理特征很有關(guān)系，GFP熒光素會隨著葉片的成熟和葉綠素的增多而減少，另外，若是應(yīng)用在禾本科植物中，厚厚的角質(zhì)層會使熒光不容易透過[6]。

3.3其他可供選擇的基因

除了常用的gus基因和GFP基因，來自玉米R基因家族的Lc基因極有希望成為一個新的報告基因。Lc調(diào)控花青素的生物合成，它在其他植物中的表達(dá)會導(dǎo)致花青素的積累[7]。用它作報告基因的優(yōu)點在于不需要昂貴的底物，且不具有破壞性。

4基因捕獲技術(shù)在水稻突變體庫構(gòu)建中的應(yīng)用

隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)的成熟和不斷完善，人們在水稻中已建立了具有一定規(guī)模的基因捕獲突變體庫[3]。Jeong等用激活標(biāo)簽法獲得了50 000個突變系，分離到27 621個插入位點序列，經(jīng)研究表明在預(yù)測的57 888個基因中共有15 166個發(fā)生插入突變[8]。Sallaud等利用3種T-DNA載體（p4978，p4984和 p4956ET15），在cv.Nipponbare中構(gòu)建了一個含有40 000個T-DNA插入株系的水稻插入突變體庫[9]。利用以gfp為報告基因的載體p4956ET15，法國的研究者們構(gòu)建了一個增強子捕獲突變體庫，并已利用該突變體庫進(jìn)行種子繁殖和表型評價的研究[10]。

2002年，我國建立了第1個水稻T-DNA插入突變體庫，該突變體庫總共獲得了12 000多個獨立的T-DNA插入株系，表型分析和分子檢測表明所獲得的植株95%為轉(zhuǎn)基因植株，單位點插入的株系約占2/3，并發(fā)現(xiàn)了一批與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的突變體，包括在株型、育性、生育期、分蘗、株高上有突變和抗病蟲、抗逆、葉色等類型的突變體。由張啟發(fā)院士主持的水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)功能基因組研究課題組也創(chuàng)建了一個大型的T-DNA插入突變體庫。至2005年時，該突變體庫含有27 000個獨立轉(zhuǎn)化子，獲得了功能基本明確且具有明顯應(yīng)用前景的新基因107個，其中有18個涉及到產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病、抗逆和營養(yǎng)高效等重要農(nóng)藝性狀的基因，如抗白葉枯病基因Xa26和Xa13、包臺型恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b、礦物質(zhì)吸收相關(guān)的檸檬酸合成酶基因CS及抗逆基因OsNAC等[11]。2006年，他們將利用增強子捕獲系統(tǒng)構(gòu)建的一個含有129 000個水稻突變株系的群體整理成RMD（Rice Mutant Database，http：//rmd.ncpgr.cn）數(shù)據(jù)庫，利用該數(shù)據(jù)庫既能進(jìn)行突變基因與調(diào)節(jié)元件的分離鑒定，也可以進(jìn)行目標(biāo)基因在特定組合或特定發(fā)育時期的異常表達(dá)模式[12]。張治國等在粳稻品種日本晴中獲得了包括基因激活標(biāo)簽系和增強子標(biāo)簽系在內(nèi)的近100 000份T-DNA獨立插入標(biāo)簽系，其中有明顯突變表型的捕獲系共4 500余份，突變性狀包括株高、株型、穗型、粒型和大小、生育期、育性、葉色、葉型、分蘗力等。Enokil等利用Ac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建水稻插入突變體庫，該突變?nèi)后w有15%~50%的插入位點，在許多Ac的插入株系中，平均有4個Ac拷貝數(shù)[13]。Greco等利用增強子捕獲載體建立了Ac/Ds插入突變體庫，該群體的T0代植株62%表現(xiàn)出了轉(zhuǎn)座活性，T1代植株92%有轉(zhuǎn)座活性，而70%的T2、T3植株Ds失去了轉(zhuǎn)座活性。對T1代植株插入位點側(cè)翼序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Ds的插入傾向于基因密度較高的區(qū)域[14]。

5結(jié)語

2005年在Nature上公布的水稻遺傳圖譜表明，水稻基因組12條染色體上共有37 554個基因。利用基因捕獲所構(gòu)建的這些水稻突變體庫，無疑為分離和研究水稻中數(shù)目龐大的基因提供了一條有效的新途徑。突變?nèi)后w的構(gòu)建為功能基因組學(xué)的深入研究搭建了一個極好的平臺，相信不斷發(fā)展和完善的基因捕獲技術(shù)將會大大促進(jìn)人們對于植物功能基因組學(xué)的研究。

（下轉(zhuǎn)第129頁）

（上接第126頁）

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注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。”