基于Box-Behnken法篩選與優(yōu)化虎杖疏松愈傷組織培養(yǎng)條件

徐瑞超，馬云桐

虎杖主含蒽醌類、黃酮類、芪類化合物等成分，現(xiàn)代藥理研究證明具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、抗菌和治療心血管疾病的作用[1～4]，其中多酚類化合物白藜蘆醇對人體具有降血脂、抗血栓、預防動脈硬化以及增強免疫功能等重要調節(jié)作用，并成為具有研究前景的抗癌藥物之一[5～7]，因而對白藜蘆醇的需求量逐日增大。為了保護虎杖野生資源，應用現(xiàn)代生物技術開展虎杖組織和細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇具有重要的現(xiàn)實意義。本試驗采用Box-Behnken法優(yōu)化虎杖愈傷組織的培養(yǎng)條件，以誘導出生長旺盛、質地疏松的愈傷組織，篩選出虎杖愈傷組織誘導、繼代的最佳培養(yǎng)條件，為虎杖細胞懸浮培養(yǎng)提供科學依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

虎杖原植物采自于四川省峨眉山，經(jīng)馬云桐教授鑒定為虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.，取健康、無病蟲害的植株為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與培養(yǎng) 選取幼嫩虎杖，用流水沖洗干凈，75%乙醇浸泡30 s，無菌水洗滌3次，再用0.1%升汞溶液消毒10 min，無菌水沖洗5～7次，切成0.5 cm大小，接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，空氣濕度為60%左右，光照強度1200 lx，光照12 h/d。

1.2.2 不同外植體誘導試驗 分別選用虎杖葉柄、葉片和莖作為外植體，接入下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d后，計算其誘導率。其中蔗糖用量為30 g.L-1，瓊脂粉為7 g.L-1。

Ⅰ MS+6-BA 2.0 mg.L-1+KT 0.3 mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1+NAA 0.3 mg.L-1

Ⅱ MS+6-BA 3.0 mg.L-1+KT 0.2 mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1

Ⅲ MS+NAA 2.0 mg.L-1+KT 0.1 mg.L-1

Ⅳ MS+6-BA 0.4 mg.L-1+NAA 1.2 mg.L-1

Ⅴ MS+CPPU 0.5 mg.L-1+NAA 0.2 mg.L-1

1.2.3 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)的對比試驗 以上試驗完成后，選擇最佳外植體（葉柄），于相應最佳誘導培養(yǎng)基中接種40瓶，接種后取20瓶進行暗培養(yǎng)，剩余20瓶進行正常光培養(yǎng)。試驗重復3次，30 d后統(tǒng)計愈傷組織增殖率。

愈傷組織的生長量的測定：接種前先稱取帶培養(yǎng)基的空瓶重，記錄數(shù)據(jù)，接種后再稱取重量，兩次重量之差便是初始接種物的初重量。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，取出培養(yǎng)物轉接到已稱量好瓶重的新鮮培養(yǎng)基上，再稱量，記錄數(shù)據(jù)，前后重量之差即為培養(yǎng)物的生長量。

1.2.4 不同的激素水平對虎杖愈傷組織增殖的影響 在前期預實驗基礎上，采用響應面方法中的Box-Behnken設計，選擇6-BA濃度、KT濃度、2,4-D濃度3個因素，做3因素3水平共17個試驗點（5個中心點）的響應面分析試驗，通過Design Expert 7.1.3軟件，對虎杖愈傷組織培養(yǎng)工藝進行分析，建立數(shù)學模型，得到最佳工藝參數(shù)。因素與水平設計見表1。

表1 Box-Behnken設計因素與水平表

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基不同激素及濃度對外植體愈傷組織誘導情況（見表2）

表2 不同的培養(yǎng)基對虎杖愈傷組織的誘導情況

接種7 d后，觀察可見：莖尖在Ⅲ號培養(yǎng)基的切口處開始膨大，接種9 d后葉柄在Ⅱ號培養(yǎng)基的兩端口開始膨大；Ⅰ號培養(yǎng)基里葉片作為外植體到12 d左右開始膨大、卷曲。10 d左右莖尖周圍出現(xiàn)顆粒狀愈傷組織，出愈時間莖尖>葉柄>葉片。葉柄在Ⅴ號培養(yǎng)基未能誘導出愈傷，在Ⅱ號培養(yǎng)基中誘導率最高為92%。葉片在Ⅰ號培養(yǎng)基中誘導率達100%，同時污染率最低。莖尖雖然出愈時間最短，可是污染率偏高，其次為葉柄。莖尖誘導的愈傷組織顏色淡黃白色，質稍疏松，其次為葉柄，葉片誘導的愈傷組織淡黃綠色，顆粒大，質地稍堅硬。由于莖尖污染率較高，由此葉柄為虎杖愈傷組織誘導的最佳外植體，相應的最佳誘導培養(yǎng)激素為：Ⅱ MS+6-BA3.0 mg.L-1+KT0.2 mg.L-1+2,4-D0.5 mg.L-1。

2.2 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對虎杖愈傷組織生長的影響

觀察可見，接種9 d后，暗培養(yǎng)的部分接種的葉柄兩端切口處有不同程度的膨大現(xiàn)象，13 d時切口膨大處裂開，并長出白色顆粒狀的愈傷組織。光培養(yǎng)的情況為：接種12 d后部分頂芽切口處出現(xiàn)膨大，15～16 d頂芽膨大處陸續(xù)長出綠色顆粒狀的愈傷組織，以后愈傷組織數(shù)量逐漸增多并變大。由此可見，在暗培養(yǎng)條件下比光培養(yǎng)條件下先形成愈傷組織。30 d后計算愈傷組織鮮重增長量，統(tǒng)計結果見表3。從表3中可見，光培養(yǎng)的愈傷組織增長量最小值和最大值分別為0.106 g和1.054 g，平均值為0.407 g；而暗培養(yǎng)分別為0.229 g和1.169 g，平均值為0.698 g。結果表明，暗培養(yǎng)對愈傷組織的生長更加有利。因此，在對虎杖的外植體進行愈傷組織誘導時，暗培養(yǎng)加快愈傷組織形成的速度，同時也更有利于其愈傷組織的生長。

表3 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)的愈傷組織鮮重增長量對比

2.3 不同的激素水平對虎杖愈傷組織增殖的影響

2.3.1 Box-Benhnken實驗結果 根據(jù)Box-Benhnken設

計進行試驗，采用響應面法對主要影響參數(shù)進行優(yōu)化，采用Design Expert7.1.3 統(tǒng)計軟件進行試驗設計與回歸分析。試驗結果見表4，回歸分析結果見表5。

表4 Box-Benhnken實驗結果

表5 回歸分析結果

2.3.2 模型擬合 采用Design Expert7.1.3軟件，對表4中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，選擇對響應值顯著的各項，可得6-B A濃度、KT濃度、及2,4-D濃度與虎杖愈傷組織增殖率的二次多項回歸方程，回歸方程為：Y=-52.77194+30.1845X1+171.8825X2+374.5975X3-0.725X1X2+6.075X1X3+53.9375X2X3-8.64175X12-260.98125X22-424.35625X32?；貧w方程高度顯著（P<0.0001），相關系數(shù)R=99.98%，說明響應值的變化有99.98%來源于所選變量。因此回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定三個參數(shù)的最佳水平。模型預測最大響應值為97.91%。由分析結果可算出各因素的最佳取值：6-BA濃度為1.9 mg.L-1，KT濃度為0.4 mg.L-1，2,4-D濃度0.5 mg.L-1。

圖1 6-BA濃度與KT濃度對虎杖愈傷組織增殖率影響的響應面及等高線圖

圖2 2,4-D濃度與6-BA濃度對虎杖愈傷組織增殖率影響的響應面及等高線圖

圖3 2,4-D濃度與KT濃度對虎杖愈傷組織增殖率影響的響應面及等高線圖

2.3.3 響應面分析法優(yōu)化 響應值對影響因素的響應曲面圖及其等高線圖，可以直觀反映各因素交互作用對響應值的影響，見圖1～圖3。通過該組圖即可對任何兩因素交互影響虎杖愈傷組織增殖的效應進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平范圍。2.3.4 模型的驗證 為了驗證虎杖愈傷組織增殖率模型方程的適用性，在選取6-BA濃度為1.9 mg.L-1，KT濃度為0.4 mg.L-1，2,4-D濃度0.5 mg.L-1的水平上，重復試驗3次，得到虎杖愈傷組織增殖率達97.78%。與實測值吻合較好，說明利用響應面分析法得到的虎杖愈傷組織增殖工藝參數(shù)是真實可靠、具有實用價值的。

3 討論

采用現(xiàn)代生物技術開展虎杖組織及細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高的優(yōu)勢，且不受地理環(huán)境及氣候等條件的影響，是解決原料資源不足的最佳途徑，而虎杖愈傷組織生長過于致密難以實現(xiàn)細胞懸浮培養(yǎng)，因此獲得疏松、增殖快的愈傷組織是實現(xiàn)虎杖細胞懸浮培養(yǎng)的前提。本文采用Box-Behnken設計方法，僅用較少的試驗組合，通過統(tǒng)計學分析，明確了虎杖愈傷組織誘導的主要因素，同時優(yōu)化篩選了虎杖愈傷組織誘導和生長的最佳培養(yǎng)基和外植體，大大提高了試驗效率?；⒄扔鷤M織的形成和生長是受多種因素影響的，而激素是影響愈傷組織誘導和生長的主要因素。目前，關于虎杖組織培養(yǎng)的研究的報道較少，曹庸等[8]通過比較虎杖不同外植體愈傷組織誘導率發(fā)現(xiàn)根莖芽的誘導率最高，為73%，而曾超珍等[9～10]研究發(fā)現(xiàn)虎杖葉柄的誘導率更高。本試驗中發(fā)現(xiàn)葉片的誘導率最高，但其過于致密；其次為葉柄，誘導率可達92%，結合疏松誘導率、疏松程度及污染率等指標綜合考慮，最終選擇葉柄作為虎杖愈傷組織誘導的最佳外植體。從試驗中還發(fā)現(xiàn)不同的光照條件對虎杖愈傷組織的誘導率有一定的影響，并得知暗培養(yǎng)對愈傷組織的生產(chǎn)更加有利，可加快愈傷組織形成的速度，因此研究愈傷組織誘導率的影響因素要兼顧光照條件。有關蔗糖、pH、有機物、氮源等非激素因子對虎杖愈傷組織的影響及虎杖細胞懸浮培養(yǎng)是后期研究的重點，該部分內容將另文討論。

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