鏈脲佐菌素建立I型糖尿病大鼠模型的劑量研究①

楊 競，徐 洋，蔡春榮，李利生，高 楊，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

1型糖尿病(TIDM)是一種自身免疫性疾病，它導(dǎo)致胰島 β細(xì)胞損害，繼而胰島素缺乏［1］。TIDM能引起代謝紊亂、血管和神經(jīng)損害、全身多器官功能障礙，使患者壽命縮短，生活質(zhì)量嚴(yán)重降低。至今，TIDM的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前尚無藥物可徹底治愈TIDM。TIDM防治及研究仍然是焦點(diǎn)。因此建立一種較理想TIDM動物模型具有重要的意義。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，在上世紀(jì)50年代被證實(shí)具有抗菌、抗腫瘤作用［2］。Rackienten和 Junod發(fā)現(xiàn) STZ具有致TIDM作用。STZ對胰島β細(xì)胞具有特異毒性，使胰島破壞，胰島素缺乏，能很好地模擬TIDM的病程，是建立糖尿病動物模型的常用方法之一。但是目前關(guān)于STZ誘導(dǎo)TIDM 的劑量眾說紛紜［3～5］，使研究者深感困惑，希望找到理想的STZ造模劑量。因此，本研究組在過去研究的基礎(chǔ)上，選擇50，65mg/kgSTZ，研究其對SD大鼠的血糖、血胰島素、胰腺病理形態(tài)學(xué)的影響，旨在探索STZ制造TIDM動物模型的理想劑量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年 SD大鼠，雄性，體重(320±10)g，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號為SCXK～(軍)2007～017。

1.1.2 試劑 STZ購自 sigma公司;碘［125I］胰島素放射免疫分析試劑購自北京科美生物技術(shù)有限公司;檸檬酸緩沖液，配制成0.1 mol/L，pH值4.2。

1.1.3 儀器 血糖儀及血糖試紙(穩(wěn)步型)，購自強(qiáng)生公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 實(shí)驗(yàn)前用血糖儀測定大鼠空腹血糖，根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(ADA)推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)血糖在3.15～6.19 mmol/L方能入選。入選的38只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，其中STZ 55組、STZ65組各16只，對照組6只，分別腹腔注射STZ55 mg/kg(STZ55組)、65 mg/kg(STZ65組)和等體積檸檬酸緩沖液(對照組)。

1.2.2 TIDM模型的制備 所有大鼠在造模前禁食12 h，臨用前以檸檬酸緩沖液將STZ配制成1%溶液。給予STZ后大鼠即出現(xiàn)多飲多食多尿的癥狀，48 h后測其空腹血糖，血糖≥7.0 mmol/L并持續(xù)升高，第7天空腹血糖≥11.1 mmol/L可視為造模成功。成模后每周檢測體重及空腹血糖，觀察大鼠的一般狀況。

1.2.3 觀察各組大鼠成模率(成模率=成模大鼠數(shù)量/造模大鼠數(shù)量)及死亡率(死亡率=死亡大鼠數(shù)量/造模大鼠數(shù)量)。

1.2.4 第28天，所有大鼠以10%水合氯醛麻醉，取血清，同位素放射免疫試劑法測血清胰島素(INS)。

1.2.5 取各組大鼠胰腺組織以4%多聚甲醛固定48 h，脫水，包埋，HE染色，觀察其形態(tài)學(xué)改變。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

數(shù)值數(shù)據(jù)以均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(S)表示，應(yīng)用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，單因素方差分析進(jìn)行差異比較。

3 結(jié)果

3.1 STZ對大鼠一般情況的影響 STZ55，STZ65組大鼠造模成功后均出現(xiàn)精神萎靡，活動度差，毛晦暗脫落，進(jìn)食量及飲水量增至造模前兩倍，尿量明顯增多，墊料潮濕且有酸臭味，需每日更換墊料2次。對照組無明顯變化。

3.2 STZ對動物死亡率及模型成功率的影響 對照組(n=6)大鼠未見死亡及空腹血糖升高。STZ55組分別于第27、28天各有1只大鼠死亡，同時，1只造模后第2天空腹血糖＜7.0 mmol/L且不升高，3只第7天 ＜11.1 mmol/L，視為未成模。STZ65組于第14、17、20、22天分別有 1只大鼠死亡;2只第7天＜11.1 mmol/L視為未成模。結(jié)果(見表1)。

表1 不同劑量的STZ所致1型糖尿病(TIDM)模型的成模率及死亡率

3.3 STZ對大鼠體重變化的影響 與對照組比較，STZ55，STZ65組成模大鼠體重均明顯減輕(均P＜0.05)，但第3周開始，STZ55組與STZ65組體重變化出現(xiàn)明顯差異。STZ55組體重開始增加，而STZ65組體重繼續(xù)減輕。結(jié)果(見圖1)。

圖1 STZ對大鼠體重影響( s，g)

3.4 STZ對大鼠空腹血糖的影響 造模后STZ55、STZ65組空腹血糖較對照組均顯著升高(均P＜0.05)。但第14天后STZ55組空腹血糖未見繼續(xù)升高，且略有下降。STZ65組空腹血糖第2、7、21、28天都高于STZ55組(均P＜0.05)，一直穩(wěn)定在高水平(≥16.7 mmol/L)，且保持升高趨勢。結(jié)果(見圖2)。

3.5 STZ對大鼠血清胰島素(INS)的影響 與對照組相比，STZ 55和STZ65組血清INS顯著降低(P＜0.05)，且STZ65組血清INS水平較STZ55組更低(P＜0.05)，結(jié)果(見表2)。

3.6 STZ對大鼠胰腺組織形態(tài)的影響 與對照組相比，STZ55和STZ65組大鼠胰腺組織出現(xiàn)異常變化，胰島正常結(jié)構(gòu)被破壞，數(shù)目減少、面積變小。而STZ 65較STZ 55組胰島減小、結(jié)構(gòu)破壞更明顯，結(jié)果(見圖3)。

圖2 STZ對大鼠空腹血糖影響(s，mmol/L)

表2 STZ對大鼠血清胰島素(INS)水平影響 (x ± s，μIU/ml)

圖3 STZ對大鼠胰腺組織形態(tài)的影響(HE染色，×400)

4 討論

TIDM的制備方法多樣，主要有化學(xué)試劑法、手術(shù)切除法、激素注射法、病毒誘導(dǎo)法、轉(zhuǎn)基因及自發(fā)糖尿病動物等。雖然手術(shù)切除部分胰腺的方法制造的糖尿病模型較穩(wěn)定，但對術(shù)后并發(fā)癥較多;激素注射法所需造模周期長，且停藥后可出現(xiàn)血糖自發(fā)恢復(fù)，目前已較少應(yīng)用;病毒誘導(dǎo)的糖尿病模型雖有一定的發(fā)展前景，但其成模率相較其他幾種方法較低，也伴有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)作用，其應(yīng)用同樣受到限制;轉(zhuǎn)基因動物模型能自發(fā)產(chǎn)生糖尿病，但飼養(yǎng)條件要求較高且動物價格昂貴，有一定的局限性。化學(xué)試劑法常用的試劑有STZ和四氧嘧啶，其中四氧嘧啶雖可制造糖尿病模型，但有較大的肝、腎毒性，且動物存活率低［6］。STZ對胰島β細(xì)胞具有特異的毒性，其致糖尿病作用可能通過其本身含有的葡萄糖部分結(jié)構(gòu)被胰島B細(xì)胞上低親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT2)轉(zhuǎn)運(yùn)，特異性地作用于胰島B細(xì)胞并引起其結(jié)構(gòu)破壞和胰島素分泌功能障礙［7］、過度激活多聚 ADP 核糖聚合酶［8］、抑制O2連接氮乙酰葡糖胺糖苷酶［9］、使胰腺組織DNA的甲基化水平增高［10］等有關(guān)。而STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型動物死亡率較低，成模率較高，模型穩(wěn)定，操作方便，價格相對低廉，是目前國內(nèi)外最常用的造模方法。但其誘導(dǎo)的TIDM的成模率與死亡率均與劑量有密切關(guān)系，大劑量可能導(dǎo)致動物存活率過低，而劑量過小可能導(dǎo)致成模率低。因此，選擇合適的劑量是造模的關(guān)鍵因素。

文獻(xiàn)報道 STZ制造 TIDM 的劑量包括50［11］、55［10］、60［5］、65［12］、70［4］及 75［3］mg/kg 等。本課題組經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)研究最終選擇55 mg/kg、65 mg/kg STZ進(jìn)行正式研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次性腹腔注射55、65 mg/kg STZ后，動物均出現(xiàn)多飲多食多尿、體重減輕、困倦;血糖升高、血胰島素水平降低等表現(xiàn)。STZ55組造模后3～4周空腹血糖比同時期對照組高，但較兩周前的血糖值有所降低。其體重變化也呈類似趨勢。這些變化提示55 mg/kg STZ所致的TIDM的模型不夠穩(wěn)定，分析原因可能與該劑量較小有關(guān)。與此現(xiàn)象不同的是:STZ65組血糖持續(xù)升高，體重持續(xù)下降，血胰島素水平下降程度更低，胰島破壞、縮小、結(jié)構(gòu)紊亂較STZ55組更為嚴(yán)重，甚至胰島消失。雖然STZ65組死亡率是STZ55組的1倍，但其成模率為 87.5%，比 STZ55組增加12.5%。本研究揭示一次性腹腔注射STZ65mg/kg是建立SD大鼠TIDM模型理想劑量。

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