不同超聲輻照聯(lián)合超聲造影劑對人孕早期絨毛組織的損傷作用

超聲造影劑的使用可為超聲診斷提供全新的影像學信息，尤其在增強血流顯像方面提供了豐富的診斷信息[1]。應用實時超聲造影模式可動態(tài)觀察病灶灌注全過程，并通過灌注順序和模式判斷病變性質(zhì)，從而提高診斷率，現(xiàn)已用于各種疾病的診斷和治療。在產(chǎn)科，可通過觀察造影劑對胎盤的灌注與灌注缺失判斷胎盤剝離大小、缺血區(qū)域及胎盤植入子宮的部位及深度，診斷胎盤早剝、胎盤梗死與胎盤植入[2,3]。目前已經(jīng)證實彩色多普勒超聲可導致胚胎組織細胞凋亡及超微結構發(fā)生改變，超聲輻照聯(lián)合超聲造影劑對動物胚胎組織的影響已有研究報道[4]，但是對于人胚胎組織的影響還缺乏臨床試驗依據(jù)。本研究旨在通過研究不同機械指數(shù)（mechanical index, MI）的超聲造影對人孕早期胎兒絨毛組織的影響，并測定凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，探討其對孕早期胎盤細胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2008-01～10在鄂爾多斯市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科就診、尿妊娠試驗陽性且自愿要求行人工流產(chǎn)的妊娠40～60d的36例健康早孕者。納入標準：①月經(jīng)周期正常，末次月經(jīng)記憶準確。②半年內(nèi)無有害理化物質(zhì)接觸史。③無特殊用藥史。④夫婦雙方均無煙酒嗜好。⑤無急、慢性疾病。排除標準：①宮外孕。②既往有陰道流血。③有自然流產(chǎn)史。④有家庭遺傳病史。⑤帶環(huán)妊娠。36例患者，年齡18～35歲，平均（27.33±5.18）歲。超聲檢查確定孕囊張力良好，孕囊大小符合孕周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均知情并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Philips iu22超聲診斷儀；C5-2寬頻探頭，探頭頻率2～5MHz； H-700 HITACHI透射電鏡；Olympus BX41光學顯微鏡。Bracco公司注射用六氟化硫微泡（SonoVueTM）造影劑；福州邁新生物技術公司鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、SP試劑盒及DAB顯色劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 按就診順序隨機將36例孕婦分為對照組、低機械指數(shù)造影組和高機械指數(shù)造影組，低機械指數(shù)造影組再分為4個亞組；每組6例受試者。

1.3.2 造影劑配制 注射用六氟化硫微泡（含SF6氣體59mg，凍干粉25mg）1支，使用前向小瓶內(nèi)注入注射用生理鹽水5ml，用力振蕩至凍干粉末完全分散。

1.3.3 孕囊造影 ①對照組：經(jīng)二維超聲確認為宮內(nèi)妊娠后24h內(nèi)行人工流產(chǎn)，取絨毛組織。②低機械指數(shù)造影組：探及孕囊后分別將成像模式切換到MI＝0.07、0.09、0.13、0.15的機器自帶的實時造影成像條件，肘靜脈團注2ml造影劑后追加注射5ml生理鹽水，照射10min，24h內(nèi)行人工流產(chǎn)術，取絨毛組織。③高機械指數(shù)造影組：MI＝1.0，照射期間擊破再灌注3次，其余步驟同上。

1.3.4 透射電鏡觀察 各組受試者流產(chǎn)后絨毛組織立即用4℃冰生理鹽水漂洗，隨即用3%戊二醛預固定（取大小約0.1mm3），4℃保存。送電鏡中心經(jīng)PBS緩沖液沖洗、1%鋨酸后固定、沖洗、逐級丙酮脫水、Epon812包埋、聚合、常規(guī)半薄切片、光學定位、超薄切片、鉛染色，透射電鏡觀察結果并攝片。

1.3.5 免疫組化檢測 各組受試者流產(chǎn)后絨毛組織立即用4℃冰生理鹽水漂洗，以10%中性甲醛固定，4℃保存，石蠟包埋、切片。免疫組化檢測采用SP法，按試劑盒說明操作，檢測Bcl-2蛋白的表達。免疫組化表達強度用JD801圖像分析軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0軟件，計量資料數(shù)據(jù)以±s 表示，符合正態(tài)分布并經(jīng)方差齊性檢驗后行單因素方差分析，計數(shù)資料采用Fisher確切概率法分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組絨毛組織的超微結構 電鏡結果顯示，對照組中有1例微絨毛排列紊亂，部分消失、斷裂，其余5例胚胎絨毛組織超微結構正常（圖1A、B）；低機械指數(shù)造影組各亞組中，MI＝0.07組中有1例微絨毛排列紊亂，部分細胞糖原增多；MI＝0.09組中2例微絨毛扭曲，排列紊亂，其中1例合體滋養(yǎng)層細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大空泡；MI＝0.13組中1例可見部分微絨毛粗細不均勻，合體滋養(yǎng)層細胞出現(xiàn)核周空泡，1例微絨毛分布不均勻，合體滋養(yǎng)層細胞胞質(zhì)內(nèi)可見多數(shù)大空泡；MI＝0.15組中1例微絨毛排列結構紊亂，合體滋養(yǎng)細胞內(nèi)可見大空泡，細胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，1例微絨毛稀少，部分斷裂，合體滋養(yǎng)細胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮；對照組與低機械指數(shù)造影組間絨毛超微結構異常率比較差異無統(tǒng)計學意義[16.7%（1/6）對29.2%（7/24）]（P＞0.05）。高機械指數(shù)造影組中3例微絨毛出現(xiàn)斷裂、丟失，部分空泡化；4例合體滋養(yǎng)層細胞核腫脹、空泡現(xiàn)象嚴重、胞質(zhì)空泡化；3例出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、滋養(yǎng)細胞膜破裂，胞質(zhì)外溢，線粒體腫脹，嵴部分消失（圖1C～E），失去正常結構；1例微絨毛斷裂，合體滋養(yǎng)層、細胞滋養(yǎng)層結構紊亂，界限不清。超微結構異常率為100%（6/6），明顯高于對照組和低機械指數(shù)造影組（P＜0.05）。

2.2 絨毛組織Bcl-2蛋白的表達 免疫組化染色顯示Bcl-2蛋白陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，表達于合體滋養(yǎng)層細胞，主要存在于胞質(zhì)中，見圖2。每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，經(jīng)JD801圖像分析軟件得出平均灰度值，見表1。

由表1可見，高機械指數(shù)造影組絨毛合體滋養(yǎng)層細胞Bcl-2蛋白表達較對照組及低機械指數(shù)造影組明顯減少（F＝454.02,P＜0.05），凋亡的抑制作用減弱，促使合體滋養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡，而其余各組Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（F＝0.76,P＞0.05）。

3 討論

表1 各組絨毛組織Bcl-2蛋白表達比較（±s, n＝6）

表1 各組絨毛組織Bcl-2蛋白表達比較（±s, n＝6）

注：（1）與高機械指數(shù)造影組比較，P＜0.05

分組 灰度值（%）對照組 99.31±0.78（1）低機械指數(shù)組MI＝0.07 100.27±1.75（1）MI＝0.09 99.32±0.92（1）MI＝0.13 99.83±0.93（1）MI＝0.15 100.24±1.52（1）高機械指數(shù)造影組（MI＝1.0） 113.66±5.18

胚胎絨毛來源于滋養(yǎng)層，是受精卵有絲分裂形成的衍生物，具有與胚胎及胎兒同樣的遺傳信息，是維持早孕胚胎發(fā)育的重要組織，一旦絨毛出現(xiàn)損傷，將對胎兒有近期或遠期影響[5]。孕早期是胎兒各臟器分化發(fā)育的關鍵時期，此期胚胎組織嬌嫩，容易在各種理化因素的影響下造成損傷，導致胎兒出生后體質(zhì)下降。此時實施超聲造影，超聲造影劑微泡作為空化核在液體中能大大增強空化效應，并可降低超聲空化閾值，對毛細血管及周圍組織產(chǎn)生一定的生物學效應，是否會影響胎兒繼續(xù)發(fā)育尚缺乏可靠依據(jù)，因此造影劑在產(chǎn)科應用中的安全性備受關注。

3.1 超聲聯(lián)合超聲造影劑的生物學效應 超聲空化效應是一種集聚能量的有效方法，它把超聲場中低能量密度變換為氣泡內(nèi)部及其周圍高能量密度特性，能量被集聚到極小的體積內(nèi)，在氣泡爆裂和振動時產(chǎn)生猛烈的作用，它是液體中高強度超聲應用的基礎，并能引起機體、細胞及微生物損傷和破壞。生物體內(nèi)產(chǎn)生空化效應的空化核很少，而超聲造影劑微泡作為空化核在液體中受聲波輻射后產(chǎn)生共振破裂，能明顯增強超聲空化效應，并可降低超聲空化閾值。動物實驗顯示，在其他影響因素不變的情況下，對比超聲對組織的損傷與機械指數(shù)有關[6]。機械指數(shù)在超聲造影中主要反映組織中產(chǎn)生空穴效應的傾向，與造影劑微泡的破裂有關[7]，不同的機械指數(shù)對微泡造影劑的影響各異，從而對局部組織產(chǎn)生的生物學效應也不盡相同。

3.2 不同機械指數(shù)超聲造影對孕早期絨毛超微結構的影響 在實施造影過程中，無論低機械指數(shù)還是高機械指數(shù)，六氟化硫微泡造影劑都不能通過胎盤屏障，只存在于母體血液循環(huán)中。從超微結構來看，早期胎盤膜由合體滋養(yǎng)層、細胞滋養(yǎng)層和基膜、絨毛結締組織及毛細血管基膜和內(nèi)皮組成。如果在造影過程中發(fā)生了空化效應，胎盤母體面毛細血管壁和滋養(yǎng)細胞會依次受累，母體面血管壁內(nèi)皮細胞壞死破裂，紅細胞外溢，滋養(yǎng)細胞壞死。各低機械指數(shù)的超聲造影由于造影劑的使用，增加了空化核，空化閾值降低，產(chǎn)生的空化效應對人早孕絨毛超微結構存在一定的影響，但對絨毛的損傷程度較小。高機械指數(shù)的超聲輻照聯(lián)合造影劑大大增加了超聲波的空化效應，此時即發(fā)生了瞬時空化，且伴有沖擊波、高速微流，使局部產(chǎn)生大量自由基，同時超氧化物歧化酶活性下降，清除自由基能力降低，大量堆積的自由基可使細胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化可使細胞通透性增強，線粒體膨脹，酶失去活性等。因此，處于空化中心附近的胚胎絨毛組織會受到嚴重損傷，最終導致早孕絨毛多發(fā)性損傷直至破壞。

電鏡結果顯示，隨機械指數(shù)的增加，絨毛的損傷程度從外到內(nèi)逐漸加重，與武艷玲[8]的研究結果一致。損傷最重的是合體滋養(yǎng)層細胞表面的微絨毛，合體滋養(yǎng)層內(nèi)胞質(zhì)空泡化，只有在高機械指數(shù)下，細胞滋養(yǎng)層細胞及絨毛中軸間質(zhì)細胞才有損傷。

3.3 不同機械指數(shù)超聲造影對孕早期絨毛Bcl-2蛋白表達的影響 凋亡在胎盤組織中是常見的生理過程，在整個妊娠過程中，時空調(diào)控的細胞凋亡在絨毛發(fā)育、母體對胎兒免疫耐受中起重要作用。妊娠早期內(nèi)細胞群增殖分化為胚外滋養(yǎng)層，通過凋亡維持一定的內(nèi)細胞群細胞數(shù)，防止胚外滋養(yǎng)層異位表達，這是受精卵種植后正常發(fā)育所必需的。這種細胞增殖與凋亡的時空調(diào)控有賴于胎盤組織中凋亡促進與抑制因子的協(xié)調(diào)作用。

凋亡的誘導和激活可由不同的刺激觸發(fā)，如生長因子的撤退、特殊受體和配體的銜接以及輕微的損傷性刺激等。Smith等[9]報道，在人類早孕胎盤合體滋養(yǎng)層中檢測到細胞凋亡，并觀察到滋養(yǎng)層細胞大量增殖，部分細胞分化，融合形成合體滋養(yǎng)層，然后部分合體滋養(yǎng)層細胞凋亡，從胎盤上脫落進入母體循環(huán)系統(tǒng)，胎盤形態(tài)的維持依賴于胎盤細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡。妊娠早期凋亡發(fā)生在母兒雙方接觸時，在種植、蛻膜化和胚胎的發(fā)育成長中起重要作用，凋亡可能在絨毛組織結構改建及功能完善等方面發(fā)揮一定的作用[10]。

本研究結果顯示，Bcl-2蛋白表達定位于絨毛合體滋養(yǎng)層細胞，在細胞滋養(yǎng)層細胞中不表達，且人早孕絨毛合體滋養(yǎng)細胞Bcl-2蛋白表達與超聲造影機械指數(shù)相關，在低機械指數(shù)條件下其變化較小，但在高機械指數(shù)條件下表達明顯減少。有學者認為，Bcl-2蛋白于孕5～7周在合體滋養(yǎng)層中高表達，可能對這些細胞有保護作用，使其不發(fā)生凋亡，有利于滋養(yǎng)層細胞的存活，使妊娠早期胚胎發(fā)育得到充足的營養(yǎng)和氧供[11,12]。本研究結果顯示，超聲輻照聯(lián)合超聲造影劑條件下，機械指數(shù)的大小可通過上述生物學效應影響人早孕絨毛合體滋養(yǎng)細胞Bcl-2蛋白的表達，高機械指數(shù)的超聲造影使其表達下降，對凋亡的抑制作用減弱，促使合體滋養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡，引起胎盤組織細胞增殖與凋亡的平衡紊亂。此時，胚胎生長發(fā)育的內(nèi)環(huán)境遭到破壞，勢必會影響胚胎的正常發(fā)育，使流產(chǎn)、胎兒出生質(zhì)量下降、早產(chǎn)、胎兒生長受限等發(fā)生的可能性增加[13]。與對照組比較，低機械指數(shù)造影組的Bcl-2蛋白表達量變化不大。目前臨床超聲造影都是應用低機械指數(shù)實時超聲造影模式對疾病進行診斷。本研究結果證實，低機械指數(shù)的診斷性超聲造影對人早孕絨毛胎盤合體滋養(yǎng)細胞Bcl-2蛋白的表達幾乎無影響。

綜上所述，不同機械指數(shù)的超聲造影對人早孕胚胎產(chǎn)生影響，其病理改變主要發(fā)生于微絨毛、合體滋養(yǎng)層細胞，其次是細胞滋養(yǎng)層，在低機械指數(shù)下，其對絨毛組織的損傷較小；在高機械指數(shù)下，絨毛組織損傷較嚴重。就本研究結果而言，低機械指數(shù)超聲造影在產(chǎn)科應用中較安全，但由于本研究樣本量較少，安全性問題仍需進一步觀察。值得一提的是，用于臨床診斷的超聲造影是在低機械指數(shù)條件下進行的，其產(chǎn)生的生物學效應對周圍組織的損傷較小，但應用超聲造影檢查仍應堅持以“盡可能小的輻射強度及盡可能短的輻射時間獲得必要的診斷信息”為原則。超聲輻照聯(lián)合超聲造影劑對人類胚胎產(chǎn)生的影響是否具有可重復性尚需進一步深入研究。

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