綠頭鴨卵黃硒含量與禽流感新城疫病毒抗體滴度關(guān)系探討

陳雪龍，齊艷萍，2，楊煥民，王曉龍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 大慶163319；3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

禽流感（AI）和新城疫（ND）是分別由禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）引起的危害禽類的烈性傳染病，因為AIV與NDV的影響極大，因此近年來關(guān)于病毒的發(fā)生、傳播及變異備受關(guān)注。早在1918年美國流感暴發(fā)時，就發(fā)現(xiàn)缺硒地區(qū)病患死亡率高，因此將硒與病毒性疾病聯(lián)系在一起。有研究發(fā)現(xiàn)，硒元素水平與病毒感染程度及其遺傳變異有很大關(guān)系，如缺硒不僅增強流感感染的嚴重程度，還可促進病毒自身的遺傳變異［1］。

綠頭鴨（Anas platyrhynchos）屬鳥綱，雁形目，鴨科，為我國常見候鳥，在大慶龍鳳濕地內(nèi)屬于優(yōu)勢種群，被列入中國國家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的陸生野生動物名錄》。本研究通過對綠頭鴨進行卵黃硒含量，以及AIV、NDV抗體監(jiān)測，來評價卵黃硒含量與病毒抗體的波動狀態(tài)，評估兩者之間的相關(guān)關(guān)系，為防控野禽病毒性傳染病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為保護區(qū)管理工作提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 H1、H5、H9亞型禽流感及新城疫抗原，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；10 mL／L雞紅細胞、抗凝劑、PBS、陽性對照雞卵黃（采用免疫過的母雞產(chǎn)后10d的卵）、陰性對照雞卵黃（采用未免疫過的母雞產(chǎn)后10d的卵）等試劑自制，硝酸、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、鐵氰化鉀等。

1.2 方法

1.2.1 卵黃的硒含量檢測 綠頭鴨卵棄去卵清后，吸取0.2g卵黃，采用我國通用的食品硒含量檢測方法（GB 5009.93－2010）中的氫化物原子熒光光譜法。

1.2.2 10mL／L雞紅細胞的制備 用長針刺入雞翅下靜脈，采血，50mL／L抗凝劑與全血的比例為1∶3～1∶4。向雞血中加入2～3倍的PBS，1 500～3 000r／min離心5～8min，棄上清，洗4～5次。加入PBS制成10mL／L雞紅細胞懸液。

1.2.3 卵黃抗體的提取 將收集的綠頭鴨卵、陽性對照雞卵黃、陰性對照雞卵黃棄去卵清，分別吸取200μL卵黃，加入800μLPBS，渦旋混勻器混勻后，3 000r／min離心10min，取上清待測。

1.2.4 血凝抑制試驗 在微量反應(yīng)板的1～12孔均加入25μLPBS，在第1孔加入25μL卵黃稀釋液，混勻。從第1孔吸取25μL混合液加入第2孔，混勻后再吸取25μL加入第3孔，如此進行倍比稀釋至第12孔，從第12孔吸取25μL棄去。第1～12孔均加入抗原，室溫放置20min。在第1～12孔均加入10mL／L雞血懸液，室溫放置20min后，進行結(jié)果判定。其中陽性血清、陰性血清同待測樣品一起進行倍比稀釋，檢測。

1.3 統(tǒng)計分析 檢測結(jié)果利用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

經(jīng)血凝抑制試驗對 H1、H5、H9亞型AIV和NDV進行卵黃HI抗體滴度檢測，在被檢的105枚綠頭鴨卵中，全部樣本均攜帶H1亞型AIV抗體，陽性率為100%，其平均抗體滴度為6.17log2；有62個樣本攜帶H5亞型AIV抗體，其陽性率為59.05%，平均抗體滴度為2.89log2；有75個樣本攜帶H9亞型AIV抗體，其陽性率為71.43%，平均抗體滴度為3.34log2；有72個樣本攜帶NDV抗體，其陽性率為68.57%，平均抗體滴度為4.22log2（見表1）。

表1 綠頭鴨AIV不同亞型、NDV卵黃抗體滴度測定

通過氫化物原子熒光光譜法進行硒含量檢測，被測的105枚卵的硒含量平均為0.48±0.15μg／g（見表2）。

表2 綠頭鴨卵黃硒含量檢測

通過相關(guān)關(guān)系分析，結(jié)果顯示，H1、H5、H9亞型AIV抗體與卵黃硒含量的相關(guān)系數(shù)分別為：0.077、0.714、0.690，ND病毒抗體與卵黃硒含量的相關(guān)系數(shù)為0.611。經(jīng)統(tǒng)計檢驗其中除H1亞型AIV抗體外，其余3種病毒抗體與卵黃硒含量均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

表3 綠頭鴨卵黃硒含量與病毒抗體的相關(guān)關(guān)系

3 分析與討論

大慶龍鳳濕地鳥類資源豐富，據(jù)統(tǒng)計共有142種鳥類，其中國家Ⅰ級保護鳥類5種，Ⅱ級保護鳥類19種，省重點保護鳥類19種。由于龍鳳濕地生態(tài)環(huán)境以蘆葦沼澤為主，因此鳥類以游禽和涉禽占絕大部分。綠頭鴨是龍鳳濕地的優(yōu)勢物種，每年春季開始在此繁殖，秋季到南方越冬，因此，野鳥病毒性傳染病的特點是隨著候鳥或水禽的遷徙而使疾病呈世界性分布［2］。自1997年，香港首次發(fā)生H5N1亞型禽流感病毒致人感染、死亡的事件以來［3］，禽流感病毒致人感染的事件不斷發(fā)生，自此開始人們更加關(guān)注野鳥的病毒性傳染病的流行特點。加強候鳥遷徙路線附近的濕地、湖泊及候鳥聚集區(qū)和交匯區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查，對世界禽類病毒性傳染病疫情的實時監(jiān)控和預(yù)警尤為重要［4］。如果親鳥接觸過AIV、NDV后，體內(nèi)會產(chǎn)生抗體，其抗體可通過卵黃直接傳遞給雛鳥，使其在生命早期面臨環(huán)境微生物侵襲時獲得保護［5］，因此，卵黃抗體水平可以在一定程度上反映親鳥的特異性病原體感染及其在繁殖環(huán)境中的病原體狀況［6］。本研究對綠頭鴨AIV和NDV的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，隨著病毒致病性的提高，綠頭鴨種群中感染并痊愈個體的比例逐漸下降。致病性較低的H1亞型AIV陽性率100%，說明幾乎所有綠頭鴨均感染過；而致病性高的H5、H9亞型AIV和NDV陽性率也較高，說明所調(diào)查的范圍內(nèi)約有59.05%、71.43%和68.57%的綠頭鴨可能曾經(jīng)感染或接觸過，但其病毒抗體滴度卻很低，這將直接影響雛鳥抵抗病毒侵襲的能力。當母源抗體HI滴度為6log2左右時，其保護率為100%，在4log2時，其保護率為50%，在2log2時，其保護率為20%［7］。由此規(guī)律可以推斷出，本地區(qū)100%雛鳥可以抵御H1亞型AIV的侵襲，而對于H5、H9亞型AIV和NDV來說，只有20%～50%的雛鳥可以與之對抗，因此說明在龍鳳濕地野鳥大面積流行H5、H9亞型AI和ND的可能性很大。

硒是機體必需的微量元素之一，也是惟一與機體抗病毒有關(guān)的元素，已證實硒能提高畜禽的體液免疫和細胞免疫功能，增強機體的抗感染能力［8］。鳥類在產(chǎn)卵期會消耗體內(nèi)大量的硒元素，從而引起機體嚴重缺硒，因此容易被高致病性病毒擊垮。這一現(xiàn)象已有實例得到證實，硒、維生素E缺乏癥可以導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞并發(fā)新城疫［9］。然而鳥類體內(nèi)消耗的的硒會輸入到卵中，以滿足繁殖所需，所以卵中硒含量最高［10］。本試驗綠頭鴨卵黃硒含量為0.48±0.15μg／g，遠遠高于達到富硒雞蛋的0.233μg／g的水平，說明綠頭鴨能夠在體內(nèi)富集足夠含量的硒元素并將其輸入到卵中，以保證雛鳥生長、發(fā)育過程對硒的需求及抵抗病毒侵襲的能力。在我國，從東北到西南有45個貧硒地帶，硒含量達到國際公布的正常臨界值0.1mg／kg的地區(qū)只有1／3，即我國2／3地區(qū)為缺硒地區(qū)，每有疫情暴發(fā)幾乎都在缺硒地帶［11］。本地區(qū)雖然地處缺硒地區(qū)，但由于龍鳳濕地保護區(qū)硒含量較高，加之綠頭鴨食物充足，使得其體內(nèi)能夠富集足夠含量的硒，這也在一定程度上提高了綠頭鴨抵抗AIV和NDV的能力。在表3中，從硒含量與不同亞型AIV和NDV的相關(guān)關(guān)系可以看出，綠頭鴨卵攜帶H1亞型AIV抗體現(xiàn)象較為普遍，且抗體滴度均較高，但在卵黃硒含量與H1亞型AIV抗體之間并無明顯的相關(guān)關(guān)系，而硒含量與H5、H9亞型的AIV和NDV之間呈明顯的正相關(guān)，即隨著硒含量的升高，綠頭鴨卵黃抗體也呈升高趨勢，這也進一步說明了硒含量在鳥類抗病毒方面具有一定的積極作用，這一作用在不同動物的試驗中也得到了一定程度的證實［12］。

對于濕地生態(tài)系統(tǒng)來說，濕地鳥類是其重要的組成部分，在濕地生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面起著舉足輕重的作用，同時也是監(jiān)測濕地環(huán)境質(zhì)量及其敏感程度的生物指標。本研究針對綠頭鴨卵黃AIV、NDV抗體及硒含量進行了一系列的調(diào)查，為監(jiān)測野生水禽病毒性疾病的發(fā)生、流行，深入研究不同病毒抗體在龍鳳濕地的分布及對人類的影響奠定基礎(chǔ)，同時為保護區(qū)管理工作提供了一個新的方法。

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