蘇海峰,蔣 月,徐國鋒,王磊杰,張 陸,張秀英
(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州 121000)
大腸桿菌存在于人和動物的腸道內(nèi),正常情況下為非致病性共棲菌,特殊條件下(如人體虛弱、免疫力降低或胃腸受損等)具有致病性,會導(dǎo)致大腸桿菌病的發(fā)生。豬大腸桿菌病就是由致病性大腸桿菌引起豬的一種急性傳染病,根據(jù)其病原、臨床癥狀、病理剖檢及流行病學(xué)特征的不同,可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
抗微生物藥物在有效遏制豬類各種大腸桿菌感染的同時,也造成了大腸桿菌的嚴(yán)重耐藥狀況,耐藥菌株增加,耐藥機制趨于復(fù)雜[1]。耐藥基因在菌株之間的傳遞。菌株耐藥譜逐年變寬,甚至某些地區(qū)出現(xiàn)耐24種藥物的菌株[2]。因而在臨床用藥中應(yīng)以細(xì)菌耐藥性調(diào)查作為科學(xué)依據(jù),這樣不僅能減少了耐藥性的擴散,對公共衛(wèi)生意義也很重大[3]。
本文通過對發(fā)病豬群進行采樣、分離鑒定、致病性試驗等分離出致病性大腸桿菌,并對其進行耐藥性試驗,對其耐藥性及耐藥譜進行分析,探討該地區(qū)致病性大腸桿菌耐藥性現(xiàn)狀,為臨床用藥提供參考。
1.1 菌株 大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。大腸桿菌臨床分離株:分離自哈爾濱市周邊地區(qū)規(guī)?;i場患黃白痢仔豬的直腸拭子。
1.2 培養(yǎng)基與試劑 試驗用麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)等各種常規(guī)培養(yǎng)基以及葡萄糖等微量生化反應(yīng)管(生產(chǎn)批號:20110315),均購自杭州天和微生物試劑有限公司。試驗用14種藥敏紙片,購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。
1.3 實驗動物 試驗用小鼠,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。
1.4 分離純化 將所采集的直腸拭子加入肉湯培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12~24h,取少量菌液于麥康凱培養(yǎng)基畫板,37℃培養(yǎng)24h,挑取圓潤粉紅色菌落進行純培養(yǎng)。
1.5 鑒定
1.5.1 鏡檢 取少量純培養(yǎng)細(xì)菌菌液進行革蘭染色,并于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài),進行初步判斷。
1.5.2 生化鑒定 根據(jù)陸承平[7]的方法,使用以下生化反應(yīng)管,即葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸、V-P、M.R.,對分離株進行鑒定。
1.6 致病性試驗 分離株搖床培養(yǎng)12h,將培養(yǎng)液以生理鹽水稀釋至5×108CFU/mL,并以0.01 mL/g體重的接種量接種小鼠腹腔,觀察小鼠死亡情況,對分離株致病性進行判定。
1.7 藥敏試驗 按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的Kirby-Bauer法進行[6],每次試驗前用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922進行質(zhì)控,藥敏試驗結(jié)果參照CLSI(2007)[7]判定標(biāo)準(zhǔn)進行。見表1。
表1 藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)
2.1 分離純化及鑒定 細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落。顯微鏡下菌體呈兩端鈍圓,革蘭染色陰性。生化試驗結(jié)果見表2。
對照陸承平著書中[5]判定結(jié)果進行判定,符合大腸桿菌的生化特征。
2.2 致病性試驗結(jié)果 對接種28株大腸桿菌培養(yǎng)物的小鼠進行觀察,36h內(nèi)全部死亡。
2.3 藥敏試驗結(jié)果
2.3.1 28株豬源致病性大腸桿菌14種抗菌藥物抑菌圈及耐藥率結(jié)果 見表3。
2.3.2 耐藥率分布 各種藥物耐藥率分布情況見圖1。以鏈霉素、氟苯尼考和復(fù)方新諾明的耐藥率最高,均在85%以上。磷霉素和多黏菌素B耐藥率最低,均低于4%。
表2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果
表3 28株豬源致病性大腸桿菌耐藥試驗
圖1 28株細(xì)菌對14種抗菌藥的耐藥率
2.3.3 耐藥表型 所分離的28株致病性大腸桿菌中存在25個耐藥表型,見表4。
2.3.4 多重耐藥性 細(xì)菌多重耐藥情況見圖2。細(xì)菌多重耐藥數(shù)以6耐和7耐最多,8耐次之;最少3耐,最高12耐。
表4 28株致病性大腸桿菌的耐藥表型
圖2 28株豬源致病性大腸桿菌多重耐藥情況
3.1 豬源致病性大腸桿菌的耐藥情況分析 本試驗分析了從哈爾濱周邊地區(qū)分離的28株豬源致病性大腸桿菌對14種獸醫(yī)臨床常用的抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示,豬源大腸桿菌分離菌株耐藥水平不斷提高,多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。除對多黏菌素B和磷霉素敏感率較高外,對目前常用和應(yīng)用時間較長的抗菌藥物,如鏈霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素、多西環(huán)素、氯霉素等產(chǎn)生了非常嚴(yán)重的耐藥性;所有菌株均呈多重耐藥,其中最少的耐藥3種,最多的耐藥12種。產(chǎn)生這種多重耐藥現(xiàn)象的原因可能是:致病性大腸桿菌在藥物的選擇性壓力下耐藥基因發(fā)生突變,適用了環(huán)境壓力而產(chǎn)生耐藥性[8];臨床上濫用抗生素,大腸桿菌可通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動元件獲得耐藥性[9]。另外,細(xì)菌對多黏菌素B耐藥率較低,敏感率較高,可為臨床用藥提供一定的指導(dǎo)作用。
在28株大腸桿菌中出現(xiàn)25個耐藥表型,多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,耐藥表型復(fù)雜,這可能和不同養(yǎng)殖場的用藥史及用藥習(xí)慣有關(guān),提示臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇治療用抗菌藥物。
3.2 耐藥性現(xiàn)狀 本試驗結(jié)果與宋立等對不同年代食品動物大腸桿菌耐藥性調(diào)查研究所顯示的趨勢大致相同,細(xì)菌多重耐藥數(shù)大幅度增加[10]。但青霉素、氯霉素等藥物耐藥率增長略有不同,這可能和不同地區(qū),用藥種類不同所致[11]。本試驗大腸桿菌耐藥情況結(jié)果與丁良君等報道相比,阿莫西林、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星耐藥率均降低28.57%~50.71%,其中環(huán)丙沙星降低最多(50.71%),磺胺甲噁唑、鏈霉素耐藥率基本不變,多西環(huán)素、多黏菌素B耐藥率分別增加15%、14.29%[12]。這可能和豬場改變常用藥物有關(guān)。值得一提的是,氯霉素在禁用之后,耐藥率由原來的100%降低到71.43%。提示在停止使用抗生素一定時間后,細(xì)菌可能逐漸恢復(fù)對其敏感性。由此可見,規(guī)范使用抗生素對于減緩細(xì)菌耐藥性的擴散和傳播具有重要的實際意義。
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