吡咯烷二硫代氨基甲酸對脂多糖致急性肺損傷大鼠NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響

王紅嫚 薛關(guān)生 萬義增 王 健 臧東鈺 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸科，遼寧 錦州 200)

急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)可引起頑固性低氧血癥，病死率極高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，缺乏有效治療措施〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是啟動眾多炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性因子，能夠與DNA結(jié)合，幾乎存在于體內(nèi)所有細(xì)胞。在脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等激活劑的刺激下，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定的κB序列結(jié)合，使炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用〔2〕。目前發(fā)現(xiàn)，ALI存在NF-κB激活，在ALI/ARDS中起著重要作用，控制NF-κB的活化可能成為治療ALI/ARDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為此，本文通過觀察LPS致大鼠ALI時(shí)肺組織胞質(zhì)、胞核中P65蛋白變化及NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氫基甲酸(PDTC)對P65蛋白分布的影響，進(jìn)一步探討PDTC對ALI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備 54只300～350 g健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為三組。對照組6只，ALI組(L組)24只;PDTC干預(yù)組(P+L組)24只;ALT組和PDTC干預(yù)組分別于腹腔注射LPS后1、2、4、8 h作為觀測時(shí)間點(diǎn)。在各不同觀測時(shí)間點(diǎn)取10%鹽酸氯胺酮溶液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核核蛋白的提取 制模后，取右肺中、下葉肺組織約100 mg，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，加入核蛋白提取裂解緩沖液 A 1.5 ml，冰上放置15～30 min，用電動勻漿器制成勻漿后加入500μl 10%NP-40，渦旋10 s，4℃、12 000 r/min離心30 s，上清即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。將沉淀物用冷PBS洗滌一次，4℃、12 000 r/min離心30 s，棄上清。加入1.5 ml核蛋白提取裂解液B，冰上放置30 min，然后4℃、12 000 r/min離心2 min，吸出上清(核蛋白)，Bradford比色法測定核蛋白濃度，并調(diào)至0.5～1.0μg/μl，置于-70℃保存。

1.2.2 Western印跡半定量檢測NF-κB p65 20μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃過夜，二抗室溫1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。將免疫印跡所得結(jié)果經(jīng)圖像掃描分析，以積分灰度值(IDV)表示P65相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

將對照組胞質(zhì)P65蛋白的IDV設(shè)為1，用其他各組P65蛋白的IDV與其的比值作為相對表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示:ALI組各時(shí)相肺組織胞質(zhì)中NF-κB P65蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較對照組顯著降低(P＜0.01)而胞核中P65蛋白表達(dá)強(qiáng)度較對照組顯著升高(P＜0.01);但PDTC干預(yù)組與ALI組比較，肺組織胞質(zhì)中P65蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較對照組升高(P＜0.05)，而胞核中P65蛋白表達(dá)強(qiáng)度較ALI組降低(P＜0.05)。見表1，圖1。

圖1 不同時(shí)相肺組織胞質(zhì)、胞核NF-κB P65蛋白表達(dá)變化

3 討論

研究表明，ALI存在著 NF-κB 激活，NF-κB 可使 TNF-α 等炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄最大化;活化后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等病理過程中發(fā)揮重要作用。它是由P50、P52、P65、c-Rel、RelB 五種亞單位組成的同源或異源二聚體，發(fā)揮主要生理功能的是P50/P65異源二聚體，其中NF-κB P65為其主要亞單位。通常狀態(tài)下，蛋白以二聚體形式與IκB抑制蛋白(NF-IκB)直接結(jié)合形成三聚體復(fù)合物 ，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。在LPS等激活劑的刺激下，IκB抑制蛋白降解，使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定的κB序列結(jié)合，其中P50與DNA結(jié)合有關(guān)，P65則因含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活。本研究發(fā)現(xiàn)ALI組各時(shí)相肺組織胞質(zhì)中P65蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較對照組顯著降低，而胞核中P65蛋白表達(dá)強(qiáng)度較對照組顯著升高。說明P65蛋白在ALI/ARDS的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，控制NF-κB的活化可能成為治療ALI/ARDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

PDTC是NF-κB的特異性抑制劑，可調(diào)節(jié)NF-κB活化，控制致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，具有抗氧化、抗細(xì)菌、真菌及抗腫瘤等特性〔3，4〕。研究發(fā)現(xiàn)，PDTC 通過抗氧化作用阻礙抑制蛋白 IκB從NF-κB復(fù)合體上解離，從而抑制NF-κB活化，阻礙NF-κB的P65、P50亞基向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞核中的表達(dá)明顯減少，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制TNF-α、白介素-1等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生〔5〕;還可直接降低NF-κB與DNA結(jié)合能力，干擾NF-κB激活的信號通路〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)，PDTC干預(yù)組與ALI組比較，肺組織胞質(zhì)中P65蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較ALI組升高，而胞核中P65蛋白表達(dá)強(qiáng)度較ALI組降低。因此，通過抑制NF-κB的活化來控制炎性介質(zhì)的過度釋放，可拓展臨床治療ALI/ARDS的新路徑。

1 中華醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷與治療指南2006〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2007;46(5):430-5.

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3 鄧朝勝，王 辰，龐寶森，等.中性粒細(xì)胞在肺血栓栓塞癥犬肺缺血-再灌注損傷中的作用〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006;29(9):603-60.

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5 Bellas RE，F(xiàn)itzGerald MJ，F(xiàn)austo N，et al.Inhibition of NF-κB activity induces apoptosis in murine hepatocytes〔J〕.Am J Pathol，1997;151(4):891-6.

6 Li YQ，Zhang ZX，Xu YJ，et al.N-Acetyl-L-cysteine and pyrrolidine dithiocar-bamate inhibited nuclear factor-kappaB activation in alveolar macrophages by different mechanisms〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2006;27(3):339-46.