雞蛋和牛奶中噁喹酸、氟甲喹殘留的檢測(cè)方法研究

李 倩，張玉潔，王鶴佳，仲 鋒，徐秉恩

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

噁喹酸和氟甲喹是第二代喹諾酮類藥物，其抗菌譜廣，殺菌力強(qiáng)，吸收快，對(duì)治療革蘭氏陰性菌感染，特別是對(duì)大腸桿菌、支原體、嗜水氣單胞菌引起的畜、禽及水生動(dòng)物疾病有較好療效［1－2］。本類藥物一般毒性較低，安全范圍大。但隨著噁喹酸和氟甲喹在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，其產(chǎn)生的毒副作用仍會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生直接的危害，因此其在可食性動(dòng)物組織中的殘留問題已經(jīng)日益引起人們的關(guān)注。農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定:噁喹酸在雞蛋中的最高殘留限量為50 μg/kg，氟甲喹在奶中的最高殘留限量為50 μg/kg。有關(guān)噁喹酸、氟甲喹在動(dòng)物性產(chǎn)品殘留檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道較多，主要是高效液相色譜法［3－4］，且多用于測(cè)定各類魚［5－6］、蝦組織中的殘留量。測(cè)定雞蛋和牛奶中的這兩種藥物殘留還未見報(bào)道。本研究旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)兩種藥物在雞蛋和牛奶中殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備 Agilent1100高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器和二元梯度洗脫系統(tǒng))C18色譜柱;保護(hù)柱;分析天平:感量0.00001 g;天平:感量0.01 g;組織勻漿機(jī);渦旋混合儀;振蕩器;高速離心機(jī);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 試劑和溶液 噁喹酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98.0%);氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99.0%);氫氧化鈉、甲酸、磷酸均為分析純;四氫呋喃、乙腈、正丙醇均為色譜純;水為去離子水。

噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱取噁喹酸、氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg于10 mL量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確量取適量噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成適宜濃度的噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)工作液。

5.0 mol/L氫氧化鈉溶液:取氫氧化鈉飽和液28 mL，加水稀釋至100 mL。

0.03 mol/L氫氧化鈉溶液:取5.0 mol/L氫氧化鈉液0.6 mL，加水稀釋至100 mL。

0.02 mol/L 磷酸溶液:取 85%磷酸 1.36 mL，加水稀釋至1000 mL。

1%甲酸乙腈溶液:取98%甲酸10 mL，加乙腈稀釋至1000 mL。

1.3 色譜條件 流動(dòng)相:0.02 mol/L磷酸溶液－乙腈－四氫呋喃(68∶16∶16);檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)325 nm，發(fā)射波長(zhǎng)369 nm;柱溫30℃;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取適量噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為3、10、50、100、300、500 ng/mL 的系列溶液。

1.5 樣品的提取 稱取(2±0.05)g試料，置50 mL離心管中，加1%甲酸乙腈溶液6 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，重復(fù)提取一遍，合并兩次上清液，加正丙醇3 mL，50～55℃減壓濃縮至干。濃縮物用流動(dòng)相2.0 mL溶解，混勻后轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，8000 r/min離心5 min，取上清液過濾膜后作為試樣溶液，供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 將繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用對(duì)照溶液依次從低濃度到高濃度，按液相色譜條件進(jìn)行分析。每一濃度進(jìn)樣3針，按其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)的對(duì)照溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖1)，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。噁喹酸和氟甲喹的線性濃度范圍為3～500 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為噁喹酸 y=0.0504x －0.0943，相關(guān)系數(shù) r=0.9992;氟甲喹 y=0.0602x －0.1549，相關(guān)系數(shù) r=0.9991。

圖1 噁喹酸、氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 方法精密度和準(zhǔn)確度 分別取雞蛋和牛奶(2±0.05)g，加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含噁喹酸和氟甲喹濃度為10～100 ng/g的添加樣品，按1.5項(xiàng)下提取處理后進(jìn)行色譜分析。噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)、空白雞蛋及添加色譜圖見圖2－圖4。取峰面積值計(jì)算噁喹酸、氟甲喹的含量，以測(cè)得量和加入量之比計(jì)算回收率。按照農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》要求，分別測(cè)定包括最高殘留限量在內(nèi)的3種濃度，按每個(gè)濃度各測(cè)5個(gè)樣品的回收率計(jì)算批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)濃度各測(cè)3批計(jì)算批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果(表1和表2)表明，方法中噁喹酸和氟甲喹在 10、50、100 ng/g添加水平的平均回收率在73% ～94%之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%，結(jié)果重復(fù)性好，回收率高，方法的準(zhǔn)確度和精密度可以滿足殘留檢測(cè)的要求。

表1 雞蛋中噁喹酸和氟甲喹回收率及批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定結(jié)果

表2 牛奶中噁喹酸和氟甲喹回收率及批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定結(jié)果

2.3 方法靈敏度 空白試料按提取方法處理后進(jìn)行色譜分析，在相應(yīng)的保留時(shí)間處，空白試料對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾。在雞蛋和牛奶中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在組織中的添加濃度分別為3、5和10 μg/kg。按照1.5項(xiàng)下提取凈化方法處理后，經(jīng)HPLC檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果顯示，添加濃度為5 μg/kg時(shí)，藥物的信噪比(S/N)約等于3，添加濃度為10 μg/kg時(shí)，信噪比均＞10，為此，確定噁喹酸、氟甲喹在雞蛋和牛奶中的檢測(cè)限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

3 討論

液—固相萃取是常用的提取、凈化方式，動(dòng)物性組織中噁喹酸、氟甲喹殘留檢測(cè)主要采用液—固相萃取的提取、凈化方法［7］，考慮到雞蛋和牛奶中雜質(zhì)較少，基質(zhì)比較干凈，因此實(shí)驗(yàn)采用液—液萃取方法，省略用固相萃取的凈化的方法，既節(jié)省了實(shí)驗(yàn)的成本，同樣達(dá)到了較為理想的色譜分離。

雞蛋和牛奶樣品一般含脂量較高。在實(shí)驗(yàn)提取過程中加入正己烷進(jìn)行除脂，但提取的結(jié)果與未加正己烷除脂的相比較，無(wú)明顯差別，因此僅使用1%甲酸乙腈提取，不加正己烷除脂，減壓濃縮的處理方法即可滿足檢測(cè)要求，并具有成本低、樣品處理速度快的特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)，建立了噁喹酸、氟甲喹在雞蛋和牛奶中的殘留檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省有機(jī)溶劑減少對(duì)環(huán)境的污染等特點(diǎn)。其方法的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度均達(dá)到了獸藥殘留檢測(cè)方法的要求，適用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

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