牛組織中氨丙啉殘留的HPLC檢測方法研究

陸春波，陳慧華，林仙軍，應(yīng)永飛，周 煒，羅成江

(浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310020)

氨丙啉(amprolium)，化學(xué)名1－〔(4－氨基－2－丙基－5－嘧啶基)甲基〕－2－甲基吡啶氯化物，是一種抗原蟲藥，從1960年開始就被廣泛應(yīng)用于防治球蟲病，具有高效、安全，不易引起球蟲耐藥性等優(yōu)點。氨丙啉毒性雖低，但長期高濃度應(yīng)用能引起雛雞硫胺缺乏而表現(xiàn)多發(fā)性神經(jīng)炎，對產(chǎn)蛋雞禁用，水貂、牛、羊可用。隨著氨丙啉在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用，其在動物性食品中的殘留問題也日益突出。美國FDA、日本、韓國、加拿大等國家均規(guī)定了氨丙啉在動物組織中的最高殘留限量，我國也作了相關(guān)規(guī)定。農(nóng)業(yè)部制定了牛組織中的最高殘留限量(MRL)［1］(牛肌肉500 μg/kg，牛脂肪2000 μg/kg，牛肝500 μg/kg，牛腎 500 μg/kg)。為保障動物源性產(chǎn)品食用安全性，保障消費者的身體健康，加強(qiáng)動物性食品中的氨丙啉殘留的監(jiān)測和檢驗工作，建立一種簡單快速、靈敏度高的氨丙啉殘留檢測方法已是刻不容緩。對飼料、畜產(chǎn)品和其他樣品中氨丙啉的檢測，國內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用的主要是高效液相色譜法(HPLC)［2－4］、液相色譜—質(zhì)譜法(LC/MS)［3－7］等方法。本研究建立了牛肌肉、肝、腎以及牛脂肪中氨丙啉殘留的高效液相色譜方法，為該藥物殘留監(jiān)控提供了一種靈敏、高效、簡便的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 鹽酸氨丙啉對照品，含量99.9%，批號 H0030811，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。Waters 2695高效液相色譜儀(配2487型紫外檢測器);XS－205電子天平(Mettler公司);SL502 N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器公司):3k30型冷凍離心機(jī)(Sigma公司);20通道固相萃取裝置(Waters公司);MS2 minishaker渦旋混勻器(IKA公司);Waters HLB固相萃取小柱(500 mg，6 cc);乙腈、甲醇為色譜純;庚烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑;冰醋酸、三乙胺為分析純。

1.2 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精密稱取適量的鹽酸氨丙啉對照品，用甲醇溶解并定容，配制成含氨丙啉100 μg/mL的貯備液，密封，－20℃保存。磷酸鹽緩沖液:取磷酸二氫鉀13.6 g，加水溶解后并稀釋至1 L，用氫氧化鈉溶液(5 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至7.0。庚烷磺酸鈉溶液:取庚烷磺酸鈉1.2 g加水至1000 mL，再加冰醋酸24 mL，三乙胺6 mL，混勻。

1.3 色譜條件色譜柱為Waters XTerraR○MS C18色譜柱，4.6 mm ×250 mm，粒徑 5 μm;進(jìn)樣量20 μL;流動相為庚烷磺酸鈉溶液 －甲醇 －乙腈(60 ∶35 ∶5，V/V);流速 1.0 mL/min;柱溫 30 ℃;檢測波長267 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取氨丙啉標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用流動相稀釋成濃度為 0.20 ～20.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，供高效液相色譜分析。以氨丙啉的峰面積為縱坐標(biāo)，以氨丙啉濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取 稱取(5±0.05)g試料于50 mL離心管中，加入乙腈10 mL，以10000 r/min速度勻質(zhì)1 min，再以5000 r/min離心5 min，收集上清液。殘渣中再加入乙腈10 mL，同樣步驟操作后合并上清液，加入正丙醇5 mL，在50℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用20.0 mL磷酸鹽緩沖液溶解殘渣，作為備用液。

1.5.2 凈化 HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，準(zhǔn)確量取1.5.1項中備用液5～10 mL過柱，用5 mL水淋洗，擠干。用4.0 mL流動相洗脫，擠干，收集洗脫液，混勻，過濾膜后供高效液相色譜分析。

1.6 方法準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白脂肪中添加定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四個不同濃度的氨丙啉進(jìn)行回收率試驗;在空白肝臟、空白肌肉、空白腎臟中添加1/2MRL、MRL、2MRL、4MRL四個不同濃度的氨丙啉進(jìn)行回收率試驗，各濃度進(jìn)行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次以上，求批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系 在濃度0.20～20.0 μg/mL的范圍內(nèi)，氨丙啉的峰面積與其濃度呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=39655x－2459.1，相關(guān)系數(shù)r2為0.9999，線性回歸圖見圖1。

圖1 氨丙啉標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化 本實驗先后使用了Waters XTerraR○MSC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)和 Waters Symmtry C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，粒徑5 μm)，對不同流動相組成的分離效果進(jìn)行了試驗，均出現(xiàn)主峰保留時間過短、易與雜質(zhì)峰混在一起的現(xiàn)象，或響應(yīng)值較低導(dǎo)致靈敏度降低。而當(dāng)流動相組成中添加離子對試劑，如庚烷磺酸鈉溶液時，峰形較好，靈敏度較高，能與雜質(zhì)峰完全分離。適當(dāng)提高庚烷磺酸鈉濃度和三乙胺的量可減小鹽酸氨丙啉峰的拖尾因子，改善峰形，但峰寬會變寬，靈敏度降低。經(jīng)反復(fù)試驗、調(diào)整，最后選定流動相為庚烷磺酸鈉溶液(庚烷磺酸鈉1.2 g加水至1000 mL，再加冰醋酸24 mL，三乙胺6 mL)－甲醇－乙腈(60∶35∶5，V/V)，此時目標(biāo)物與雜質(zhì)能很好的分離，且峰形較好。

2.3 樣品的提取與凈化 本方法采用乙腈、磷酸鹽緩沖液分別對樣品進(jìn)行提取。并在樣品量5 g(牛脂肪、牛腎臟)的前提下對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化時氨丙林在牛脂肪、牛腎臟的添加濃度均為1000 μg/kg，考慮到盡量減少有機(jī)溶劑用量和節(jié)約時間，本方法采用兩次提取，每次提取溶液用量10 mL進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，乙腈對樣品進(jìn)行提取都得到了較好的回收率，用磷酸鹽緩沖液，由于提取后特別是牛腎臟組織，較為渾濁，無法過SPE柱進(jìn)行凈化。

2.4 固相萃取條件的選擇 考慮到氨丙啉的理化性質(zhì)，采用C18、WCX柱和HLB柱固相萃取小柱，對牛脂肪1000 μg/kg添加做了回收率試驗，根據(jù)各自的最佳條件考察除雜質(zhì)效果和回收率，經(jīng)過反復(fù)試驗比較，選擇HLB柱作為牛組織中氨丙啉殘留測定的凈化柱，可以達(dá)到較好的凈化目的，且過柱回收率在80%以上。分別用甲醇5 mL，水5 mL充分活化HLB柱，準(zhǔn)確移取5.0～10.0 mL備用液上柱，控制過柱速度在1 mL/min以內(nèi)。用水5 mL淋洗HLB固相萃取柱，擠干HLB柱，用流動相4.0 mL洗脫;另取4 mL流動相重復(fù)一次，同法檢測未發(fā)現(xiàn)氨丙啉，說明4.0 mL流動相可以將吸附在柱子上的氨丙啉完全洗脫下來。

2.5 檢測限和定量限 本方法稱取6份空白組織，按照1.5項下步驟處理后，測得基線噪音值，求其平均值，按信噪比S/N=3為檢測限，S/N=10為定量限，求得在牛的脂肪，肌肉、肝臟和腎臟中的檢測限為 100 μg/kg，定量限為 250 μg/kg，均低于國家規(guī)定的牛組織中的最高殘留限量要求，表明該方法可行，完全能滿足殘留分析要求。

2.6 準(zhǔn)確度和精密度 在牛脂肪中添加濃度為200、1000、2000 和4000 μg/kg，在牛肌肉、肝和腎中添加濃度為250、500、1000 和2000 μg/kg 進(jìn)行添加回收率試驗。牛肉、牛肝、牛腎在250～2000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為60% ～110%;牛脂肪在200～4000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為70% ～110%，批內(nèi)RSD＜15%，批間RSD＜15%。結(jié)果見表1，氨丙啉標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2，各組織的添加色譜圖選取牛脂肪空白、添加氨丙啉的色譜圖(圖3、圖4)為代表。

表1 空白牛組織中氨丙啉添加回收率試驗結(jié)果

續(xù)表

圖4 空白牛脂肪添加試樣(1000 μg/kg)的色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了氨丙啉殘留方法，采用乙腈提取，用HLB固相萃取小柱凈化，提取效果好，回收率在60%以上。在牛的脂肪、肌肉、肝臟和腎臟中的檢測限為100 μg/kg，在牛的肌肉、肝臟、腎臟中定量限為 250 μg/kg，在牛的脂肪中定量限為200 μg/kg。批內(nèi) RSD ＜15%，批間 RSD＜15%。此方法可以為該藥物的監(jiān)控提供技術(shù)支持和保障，保證國際之間正常貿(mào)易往來、保障人類健康，具有十分重要的意義和實用價值。

［1］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號公告［Z］.動物性食品中獸藥最高殘留限量，2002.

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