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    Sf9昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝研究

    2012-05-29 10:16:20秦紅剛漆世華謝紅玲溫文生吳玉石
    中國獸藥雜志 2012年8期
    關(guān)鍵詞:傳代昆蟲反應(yīng)器

    李 偉,秦紅剛,張 萍,漆世華,朱 薇,王 威,謝紅玲,溫文生,吳玉石

    (武漢中博生物股份有限公司,武漢 430070)

    昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的新型表達(dá)載體系統(tǒng),據(jù)報(bào)道現(xiàn)已成功應(yīng)用于500多種外源蛋白的表達(dá)[1]。相比貼壁依附型的哺乳動物細(xì)胞,昆蟲細(xì)胞可直接進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而更具有優(yōu)越性。不同昆蟲細(xì)胞系在不同培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)及代謝參數(shù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]。理論及實(shí)驗(yàn)表明,利用重組桿狀病毒感染高密度的Sf9細(xì)胞可獲得高水平的外源蛋白的表達(dá)[3]。本文對Sf9細(xì)胞在Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基和僅添加10%血清的Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長情況進(jìn)行了比較,同時(shí)利用Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基從搖瓶放大到14 L攪拌式生物反應(yīng)器對培養(yǎng)工藝做了研究,為昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模高密度培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞 Sf9昆蟲細(xì)胞由美國 Newport&Prota tek公司惠贈,經(jīng)搖瓶懸浮培養(yǎng)馴化所得。

    1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基及添加劑PF68、Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自Gibco公司;小牛血清購自武漢三利生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、氨、乳酸、谷氨酰胺及總氨基酸檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)搖床為上海智誠分析儀器制造有限公司;分光光度計(jì)為上海尤尼柯2100可見分光光度計(jì);生物反應(yīng)器為荷蘭Applikon 14L攪拌式生物反應(yīng)器。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞監(jiān)測 細(xì)胞通過血球計(jì)數(shù)板來計(jì)數(shù),經(jīng)臺盼藍(lán)染色來測定細(xì)胞活性。

    1.2.2 生化分析 葡萄糖、氨、乳酸、谷氨酰胺及總氨基酸的測定嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行,結(jié)果在紫外可見光分光光度計(jì)上測得。

    1.2.3 Sf9細(xì)胞搖瓶懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞經(jīng)克氏瓶靜止培養(yǎng)復(fù)蘇后,以傳代后初始密度不低于每毫升2.5×105的接種量逐步放大到250 mL搖瓶,搖瓶裝液體積為50~100 mL,要求細(xì)胞生長密度不高于5×106/mL時(shí)進(jìn)行傳代。Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基中添加0.1%的 Pluronic F68,Grace培養(yǎng)基中添加10%的小牛血清,培養(yǎng)溫度27~30℃,搖床轉(zhuǎn)速100~120 r/min。

    1.2.4 Sf9細(xì)胞生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng) 將搖瓶種子細(xì)胞逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后,按接種生物反應(yīng)器細(xì)胞初始密度不低于2.5×105/mL的接種量接種。培養(yǎng)基中加入0.1%的Pluronic F68,采用Vortex攪拌漿微泡通氣模式,培養(yǎng)溫度27~30℃,攪拌轉(zhuǎn)速150~200 r/min,DO控制在50% ~80%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基搖瓶懸浮培養(yǎng) Sf9細(xì)胞在250 mL搖瓶中培養(yǎng)的生長曲線見圖1。細(xì)胞初始密度為2.8×105/mL,接種細(xì)胞后4~16 h細(xì)胞生長處于靜止期,16~28 h細(xì)胞開始逐步適應(yīng)開始快速生長,28~88 h細(xì)胞處于對數(shù)生長階段,此時(shí)細(xì)胞生長不受限制,細(xì)胞比生長速率為0.032/h(圖2),倍增時(shí)間為20 h,且對數(shù)生長期可維持60 h以上。整個(gè)培養(yǎng)過程細(xì)胞活性在90%以上,細(xì)胞分散良好。

    2.2 Grace培養(yǎng)基添加有10%血清搖瓶懸浮培養(yǎng)將無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞懸液離心后重懸于添加10%小牛血清的Grace基本培養(yǎng)基中,適應(yīng)培養(yǎng)48 h后傳代,接種250 mL搖瓶,細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)生長情況如圖3。初始細(xì)胞密度為4.3×105/mL,細(xì)胞比生長速率不高于0.02/h,計(jì)數(shù)細(xì)胞倍增時(shí)間約為37 h,且細(xì)胞生長狀態(tài)不是很好,繼續(xù)傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎不生長,細(xì)胞形態(tài)呈梭狀。嘗試在培養(yǎng)基中添加0.5%的Pluronic F68,效果依然沒有改善。可見添加有10%血清的Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比無血清Sf900Ⅱ培養(yǎng)基效果要差。有文獻(xiàn)報(bào)道在培養(yǎng)基中添加酵母水解物和乳清蛋白水解物Sf9細(xì)胞生長良好[4]。

    圖3 Sf9細(xì)胞Grace培養(yǎng)基細(xì)胞生長曲線

    2.3 Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基添加1%血清懸浮培養(yǎng)血清有促進(jìn)細(xì)胞生長性能且對細(xì)胞生長有剪切保護(hù)的作用[5]。為進(jìn)一步提高Sf9細(xì)胞活性及生長速率,嘗試在Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基中添加1%的小牛血清考察其生長情況,同時(shí)設(shè)Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基作對照。細(xì)胞培養(yǎng)60 h后傳代,情況如圖4所示??梢钥闯?,血清的加入對細(xì)胞生長速率及細(xì)胞活性的提高有一定的影響,傳代培養(yǎng)60 h細(xì)胞生長密度提高30%,細(xì)胞活性提高3%??梢娞砑优Q鍖?xì)胞生長及活性提高有比較顯著的促進(jìn)作用,但產(chǎn)品的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。

    圖4 Sf9細(xì)胞無血清培養(yǎng)基與添加1%血清生長對照

    2.4 攪拌式生物反應(yīng)器Sf900Ⅱ無血清懸浮培養(yǎng)為了擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模,嘗試用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Sf9細(xì)胞,種子細(xì)胞來源于搖瓶懸浮培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大到一定體積后接種生物反應(yīng)器,初始細(xì)胞密度不低于2.5×105/mL,每隔12 h取樣計(jì)數(shù)并作檢測,結(jié)果如圖5-圖10所示。圖5顯示,細(xì)胞在前36 h生長緩慢,可能與接種細(xì)胞密度低有關(guān);細(xì)胞培養(yǎng)120 h達(dá)到最高細(xì)胞密度1.4×107/mL,這時(shí)細(xì)胞活性顯著下降到80%以下,取樣觀察此時(shí)細(xì)胞有部分結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。有報(bào)道稱,乳酸的積累可能是引起細(xì)胞結(jié)團(tuán)的重要原因[6]。整個(gè)培養(yǎng)過程,葡萄糖作為最重要的碳源,其總的消耗量約為初始含量的3/4(圖6),谷氨酰胺作為主要的氮源物質(zhì)變化不明顯(圖7)。細(xì)胞培養(yǎng)后期,副產(chǎn)物乳酸和氨積累較為明顯(圖8、圖9),這可能是引起細(xì)胞活性降低的重要原因之一。整個(gè)過程中,培養(yǎng)基中總氨基酸的消耗量不足初始總氨基酸含量的1/4(圖10),主要氨基酸的耗盡也會嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長[7]。

    3 討論

    3.1 隨著生物技術(shù)的發(fā)展,利用無血清低蛋白培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白類藥物是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。利用Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf9昆蟲細(xì)胞具有細(xì)胞密度高,培養(yǎng)基成分明確,且易于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)等具有更好的應(yīng)用前景。

    3.2 血清對細(xì)胞生長有一定的保護(hù)作用,可明顯提高細(xì)胞的活性,本文也從實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。但隨后的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),隨著細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的不斷適應(yīng)培養(yǎng)和傳代,血清對細(xì)胞活性的改善不明顯。

    3.3 動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)是其工業(yè)化的前提。利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Sf9細(xì)胞可獲得較高的細(xì)胞密度,但后期細(xì)胞活性明顯下降,分析原因如下:

    ①氣泡。生物反應(yīng)器培養(yǎng)后期細(xì)胞密度比較高,為了滿足溶氧需求,過程需增大通氣量,故而會形成較多的氣泡,而氣泡破裂形成的張力對細(xì)胞剪切損傷比較大[8]。

    ②攪拌。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞對攪拌敏感性較添加了血清培養(yǎng)的更高。

    ③營養(yǎng)物質(zhì)的限制和代謝副產(chǎn)物的積累。培養(yǎng)過程中總的氨基酸的消耗,特別是主要氨基酸的消耗可能會限制細(xì)胞生長,代謝副產(chǎn)物如乳酸、氨的積累過多會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,對細(xì)胞的生長有比較大的抑制作用。

    ④滲透壓。細(xì)胞生長有一個(gè)適宜的滲透壓范圍,隨著后期代謝產(chǎn)酸,培養(yǎng)液中滲透壓會隨之升高,引起細(xì)胞活性水分子的流失,是培養(yǎng)后期細(xì)胞活性降低的一個(gè)重要原因。通過不斷優(yōu)化培養(yǎng)工藝條件,如改變通氣和攪拌方式,設(shè)計(jì)個(gè)性化培養(yǎng)基,調(diào)整培養(yǎng)方式及補(bǔ)料策略等來改善細(xì)胞活性有待進(jìn)一步研究,為今后利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)蛋白類藥物打下基礎(chǔ)。

    [1]Miller L K.High level expression in insect cells[J].Curr Opin Genet Dev,1993,3:97 -101.

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    [4]張寶珠.昆蟲細(xì)胞(Sf9)無血清培養(yǎng)的研究[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2005,10(5):53 -55.

    [5]金小紅,孟哲峰,陳存國.小牛血清和胎牛血清對Sf9細(xì)胞生長和重組蛋白表達(dá)影響的比較[J].中國病理生理雜志,2006,22(2):415 -416.

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