HPLC－PDA法同時(shí)測(cè)定黃芪多糖注射液中非法添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物

郝利華，于曉輝，董玲玲，萬仁玲，宋 洋

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266000)

黃芪多糖注射液具有提高機(jī)體免疫力的功效，在獸醫(yī)臨床上作為輔助治療應(yīng)用廣泛。但一些不法企業(yè)利用中藥成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)落后等缺點(diǎn)，在該注射液中非法添加化學(xué)類藥物，以在短時(shí)間內(nèi)起到明顯的療效，對(duì)用藥安全帶來巨大風(fēng)險(xiǎn)。本文采用旨在建立快速、簡(jiǎn)便的方法以檢測(cè)出其中添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物:安乃近、安替比林、對(duì)乙酰氨基酚和氨基比林。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Waters 2695，二極管陣列檢測(cè)器2998(PDA)，美國(guó)waters公司;METTLER AE240精密天平，精度0.01 mg，梅特勒精密儀器廠。安乃近對(duì)照品:批號(hào)H0291105，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;安替比林對(duì)照品:批號(hào)H0020907，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品:批號(hào)100018－200408，中國(guó)藥品生物制品檢定所;氨基比林(高純?cè)噭?:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。供試品:25批不同廠家黃芪多糖注射液，市場(chǎng)購(gòu)買;黃芪多糖提取物(含量以葡萄糖計(jì)25%):中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［1－2］與系統(tǒng)適用性 色譜柱采用迪馬鉆石 C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以磷酸鹽緩沖液磷酸二氫鈉6.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺1mL，用氫氧化鈉試液調(diào)pH值至7.0)－甲醇(70 ∶30，V/V)為流動(dòng)相;進(jìn)樣量 10 μL，流速1.0 mL/min。采用二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為190～400 nm，分辨率為1.2 nm，記錄229 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。

2.2 分離度測(cè)定 分離度測(cè)定溶液:取安乃近對(duì)照品60 mg，安替比林、氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品各25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。(參照分離度測(cè)定溶液，分別制備對(duì)照品溶液，濃度分別為安乃近0.48 mg/mL，氨基比林、安替比林和對(duì)乙酰氨基酚0.24 mg/mL)。

供試品溶液:精密量取供試品1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

陰性對(duì)照溶液(無添加黃芪多糖溶液):取黃芪多糖提取物4 g(25%)，加水100 mL制成每1 mL中含0.1g(以葡萄糖計(jì))的溶液。

取上述分離度測(cè)定溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。四種待測(cè)成分完全分離，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。

圖1 分離度測(cè)定結(jié)果色譜圖

2.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各色譜圖峰面積。結(jié)果各主峰峰面積RSD均小于0.8%，表明精密度較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，結(jié)果各主峰峰面積RSD均小于1.2%，表明穩(wěn)定性較好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取安乃近對(duì)照品30、24、36 mg各三份，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別加陰性對(duì)照溶液各0.1 mL，按混合對(duì)照品溶液制備中稀釋步驟稀釋。

分別取安替比林、對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林對(duì)照品10、12.5、15 mg 各三份，精密稱定，置 25 mL量瓶中，加陰性對(duì)照溶液0.2 mL，照混合對(duì)照品溶液制備稀釋步驟稀釋。

按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果顯示，安乃近、安替比林、氨基比林和對(duì)乙酰氨基酚的平均回收率分別為99.2%、99.9%、99.4%和100.3%;RSD 分別為 0.4%、0.5%、0.3%和0.7%。

2.6 線性與范圍 取安乃近對(duì)照品約60 mg，安替比林、氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚各25 mg，一同置于50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1、3、5、7、9 mL 于 25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定安乃近、安替比林、氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.7 檢測(cè)限 黃芪多糖儲(chǔ)備液(安乃近檢測(cè)限用):取陰性對(duì)照溶液0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

黃芪多糖儲(chǔ)備液(安替比林、氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚檢測(cè)限用):取陰性對(duì)照溶液0.2mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

檢測(cè)限溶液制備:分別取安乃近、安替比林、氨基比林、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品溶液加甲醇進(jìn)一步稀釋至適宜濃度，加對(duì)應(yīng)黃芪多糖儲(chǔ)備液5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，依法測(cè)定。光譜圖失真前的濃度為該測(cè)試藥物的檢測(cè)限，光譜圖未失真且S/N≥10為定量限。

2.8 耐用性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，分別采用迪馬 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、AT LiCHROM C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Alltima C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)三種色譜柱，改變流動(dòng)相比例，水相—有機(jī)相分別為70∶30、65∶35和75∶25，按上述方法操作，結(jié)果四種成分仍能很好地分離且保留時(shí)間合理。在最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇中流速的變化影響也不大，本方法的耐用性較好。

2.9 樣品測(cè)定及結(jié)果判斷 供試品溶液制備:取供試品1 mL，加甲醇100.0 mL，搖勻即得。按2.2項(xiàng)方法制備各對(duì)照品溶液。分別精密量取供試品溶液與各對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)25批供試品進(jìn)行測(cè)定。供試品色譜圖中如出現(xiàn)色譜峰與相應(yīng)對(duì)照品峰保留時(shí)間一致(差異小于等于±5%);在大于190 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，供試品出現(xiàn)的色譜峰與相應(yīng)對(duì)照品色譜峰相對(duì)峰高大于10%時(shí)，兩者光譜圖無明顯差異(必要時(shí)可調(diào)整供試品溶液的濃度);最大吸收波長(zhǎng)一致(差異小于等于±2 nm)，判為檢出被測(cè)試藥物。

結(jié)果顯示25批樣品中7批檢出安乃近，1批檢出對(duì)乙酰氨基酚，結(jié)果見表3。色譜圖及光譜圖見圖2。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 mg/mL

其中100109除檢出對(duì)乙酰氨基酚，100201、20100201、20100901除檢出安乃近外，另有峰的保留時(shí)間、光譜指數(shù)圖(見圖2)非本文所列的目標(biāo)化合物，其成分有待進(jìn)一步分析。

圖2 對(duì)照品、陽(yáng)性樣品光譜指數(shù)圖及色譜圖

3 討論

3.1 HPLC－PDA檢測(cè)方法利用待測(cè)物與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照品有相同的最大吸收波長(zhǎng)，兩者之間的偏差應(yīng)在±2 nm之內(nèi)，另根據(jù)保留時(shí)間的一致性可確定檢出藥物與其對(duì)應(yīng)對(duì)照品為同一物質(zhì)，而進(jìn)行定性與定量測(cè)定。

3.2 本試驗(yàn)分別采用水、甲醇、甲醇－水(30∶70)為溶媒，進(jìn)行了四種藥物的溶解比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶媒中含水時(shí)，安乃近易降解，見圖2中安乃近對(duì)照品色譜圖(3)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，主要降解產(chǎn)物為4－甲氨基安替比林［3］(MAA)。因而最終確定以甲醇為溶媒。在樣品測(cè)定時(shí)，樣品為水溶液，均可檢測(cè)到MAA，因此測(cè)定結(jié)果中安乃近的含量并不能完全反應(yīng)其實(shí)際添加量。

3.3 取相應(yīng)對(duì)照品加甲醇稀釋制成一定濃度的溶液，在本色譜條件下進(jìn)樣，確定該化合物的峰位并提取其光譜圖指數(shù)圖，以上四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物在229 nm左右均有吸收，且考慮安乃近在其他波長(zhǎng)處吸收較弱并參考有關(guān)文獻(xiàn)［2］，選擇229 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 四種藥物藥效濃度不同，在黃芪多糖注射液中的添加量也不同，本研究在做回收試驗(yàn)時(shí)，以各藥物在注射液中的規(guī)格為100%添加。樣品測(cè)定時(shí)，供試品溶液濃度可能與對(duì)照品濃度不匹配，因摻假過程復(fù)雜，有的非只加一種成分，因此可根據(jù)測(cè)定結(jié)果調(diào)整供試品取樣量，使檢出成分色譜峰峰面積盡可能與對(duì)照品峰面積接近。

4 結(jié)論

在該色譜系統(tǒng)中黃芪多糖無紫外吸收對(duì)檢出無干擾，因此可通過樣品峰與對(duì)照品峰的保留時(shí)間、峰純度以及光譜特征三方面的對(duì)比來確定黃芪多糖注射液中是否非法添加有該4種藥物，方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。本文檢測(cè)了25批市售黃芪多糖注射液，發(fā)現(xiàn)1批添加對(duì)乙酰氨基酚;7批檢出安乃近。由于化學(xué)藥品添加量一般較大，因此摻偽的色譜峰容易識(shí)別。使用本文的方法，可以使黃芪多糖注射液中的非法添加檢出更簡(jiǎn)單、系統(tǒng)。

［1］劉紅云，鄭 舉，張 莉，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定安痛定注射液中氨基比林和安替比林的含量［J］.中國(guó)獸藥雜志，2009，43(9):5－7

［2］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二〇一〇年版二部［S］.

［3］沈金燦，龐國(guó)芳，謝麗琪，等.牛和豬肌肉組織中安乃近代謝物殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析［J］.化學(xué)分析，2007，35(11):1565－1569.