廣西黑山羊羊種布魯氏菌的分離和鑒定

李常挺，李 軍，覃俊江，楊 威，陳澤祥，趙 武

（1.廣西隆安縣動物疫病預防控制中心，廣西 隆安 532700；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；4.隆安縣水產畜牧獸醫(yī)局，廣西 隆安 532700）

廣西黑山羊是我國肉用山羊品種之一，具有被毛全黑、適應性強、肉質鮮嫩、營養(yǎng)豐富等優(yōu)良特性。布魯氏菌病是由布魯氏菌屬細菌引起的人畜共患傳染病，其主要特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產、不育[1]。廣西自50年代發(fā)生布魯氏菌病疫情以來主要以豬布魯氏菌病為主，牛和羊基本無疫情[2-3]。2000年以后，由于規(guī)?；B(yǎng)殖步伐加快、家畜流動性大增，不少農戶陸續(xù)從外省引進牛羊飼養(yǎng)，但是他們對《中華人民共和國動物防疫法》和《種畜禽管理條例》缺乏了解，沒有申報就盲目私自從外省購買家畜，2002年牛種布魯氏菌病疫情和2004年羊種布魯氏菌病疫情就是通過無序引種的方式引入廣西[4-5]。最近隆安縣某黑山羊養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的黑山羊多次出現流產和死胎，流產多發(fā)生于黑山羊懷孕后的3～4個月，近半年內整個羊群母羊流產達到60%。經現場調查和實驗室檢測，證實該群黑山羊感染羊種布魯氏菌病。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 該羊群血清10份（公畜血清1份，母畜血清9份）；流產死胎2只。

1.1.2 主要試劑和儀器 布魯氏菌液體培養(yǎng)基購自美國BD公司，胰蛋白示購自英國Oxiod公司，馬血清購自美國Thermo公司，布魯氏菌虎紅凝集抗原和凝集試管抗原購自中國獸藥監(jiān)察所，細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Marker 2購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR儀購自日本TaKaRa公司，凝膠成像系統購自美國Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 血清學檢測 首先使用虎紅平板凝集試驗對黑山羊血清進行布魯氏菌病陽性抗體的初篩，陽性血清再按照《布氏病試管凝集試驗（GB/T18646）》進行確認[6]。

1.2.3 細菌分離 將流產胎兒先用無菌生理鹽水清洗干凈，然后放在3%的來蘇兒水中浸泡30 min，取出在無菌條件下進行解剖，取淋巴結、肝、脾、肺、心血等病料分別接種5%馬血清胰蛋白示培養(yǎng)基上，置5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察培養(yǎng)基上細菌生長情況。

1.2.4 布魯氏菌的PCR鑒定 應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)基上濕潤、光滑、圓形、革蘭氏染色為陰性小桿菌的細菌基因組DNA，按陳澤祥等建立的PCR檢測方法對細菌進行布魯氏菌的PCR鑒定[7]。使用AMOS-PCR方法進行布魯氏菌種型的PCR鑒定[8]。以羊種布魯氏菌5號疫苗為陽性對照。

2 結果

2.1 布魯氏菌抗體檢測 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗結果表明，所檢10份黑山羊血清全部出現陽性反應。對這10份黑山羊血清進行布魯氏菌試管凝集試驗，結果有8份山羊血清（1頭公羊和7頭母羊）呈布魯氏菌抗體陽性反應。

2.3 細菌分離培養(yǎng) 流產胎兒淋巴結、肝、脾、肺、心血接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)到48 h時，均看見有細菌生長，培養(yǎng)到72 h觀察到白色、圓形突起、針尖大小的菌落。將菌落抹片、火焰固定，革蘭氏染色顯微鏡觀察細菌呈紅色、單個排列、球狀。在清潔無油脂的玻片上，一端滴一滴滅菌生理鹽水，一端滴一滴從中國獸醫(yī)監(jiān)察所購買的布魯氏桿菌病陽性血清，然后用接種環(huán)取少量菌落分別放入生理鹽水和陽性血清內，輕輕研磨、混勻，觀察凝集情況。結果生理鹽水不凝集，陽性血清內有沙粒狀的凝集反應。說明分離的細菌為光滑型布氏桿菌。

2.4 細菌的PCR鑒定 按陳澤祥等建立的PCR檢測方法對細菌進行布魯氏菌的PCR鑒定，PCR產物電泳出現布魯氏菌193 bp的目的條帶（圖1），可確定該細菌為布魯氏菌。

利用AMOS-PCR對分離的布魯氏菌進行種型鑒定，PCR電泳結果顯示在731 bp處出現目的條帶（圖2），將PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序，測序結果為羊種布魯氏菌，可以確定分離布氏菌為羊種布氏桿菌。

2.5 疫情的處理 根據黑山羊的臨床癥狀、血清學診斷和流產胎兒分離細菌鑒定結果，確定該病例為羊種布魯氏菌病。結果確定后立即根據農業(yè)部《布魯氏菌病防治技術規(guī)范》（農醫(yī)發(fā)[2007]12號）啟動疫情處理程序：縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所下文，立即進行全群撲殺，無害化處理；對羊欄、場地和污染物進行了嚴格消毒，并對同村飼養(yǎng)的山羊、種豬、牛進行監(jiān)測，結果沒有發(fā)現布魯氏菌病病畜。

3 討論

近年來廣西山羊也曾檢測出過布魯氏菌血清抗體陽性羊，但沒有分離出布氏菌。此次在廣西黑山羊血清中檢測到布氏菌抗體陽性，流產胎兒分離出羊種布魯氏菌，說明廣西山羊也面臨著布魯氏菌病的嚴重威脅。家畜飼養(yǎng)量劇增、種畜調運頻繁、流通環(huán)節(jié)檢疫監(jiān)管工作難度大及缺乏防范意識等因素是導致廣西出現山羊布魯氏菌病的主要原因。為有效防治布魯氏菌病的發(fā)生流行，建議應加強領導，加大防治經費投入，將防治工作納入長期發(fā)展規(guī)劃；強化檢疫監(jiān)督執(zhí)法，重點加強產地檢疫工作和引種申報工作，對未經報批擅自引種和依法應當檢疫而未經檢疫等違法違規(guī)行為進行嚴厲處罰；建立健全撲殺動物補償制度，對檢測出陽性病畜要堅決予以撲殺無害化處理；各部門要加強協作，密切配合，并營造良好的防疫氛圍，促使全社會共同參與，努力從動物源頭上控制布魯氏菌病的發(fā)生流行，有力保障畜牧業(yè)的快速發(fā)展與維護人民群眾的身體健康。

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