河北進(jìn)境種用動(dòng)物衣原體血清學(xué)檢測

王建昌，付 琦，王金鳳，田振祥

（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北 石家莊 050051）

衣原體（Chlamydia）是一種專一性細(xì)胞內(nèi)病原，具有非常廣譜的宿主，并能在人和動(dòng)物等宿主中引起腸炎、肺炎、流產(chǎn)等多種疾病[1-3]；而其中的鸚鵡熱衣原體主要引起動(dòng)物的流產(chǎn)、肺炎、腹瀉以及人類的肺炎、結(jié)膜炎、尿道炎等。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將此病列為必須通報(bào)疾病[4]，我國列為二類傳染病[5]。禽衣原體病是由鸚鵡熱嗜性衣原體引起的一種傳染病，其中不同禽種易感性不同，臨床癥狀的差異取決于鳥的品種、年齡以及衣原體菌株，以鸚鵡和鴿子易感。而雞對鸚鵡熱嗜性衣原體的抵抗力較強(qiáng)，雞衣原體病只有幼年雞發(fā)生急性感染時(shí)出現(xiàn)死亡，真正發(fā)生流行的很少。大多數(shù)自然感染的雞，癥狀不明顯，主要表現(xiàn)沉郁、拉稀、呼吸困難、結(jié)膜炎、漸進(jìn)性消瘦、衰竭死亡。病理剖檢以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝腫大、肝周炎和脾腫大等特征[6]。豬衣原體病是由鸚鵡熱嗜性衣原體和流產(chǎn)嗜性衣原體引起的一種慢性、接觸性人畜共患傳染病，臨床上以妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔，各年齡段豬發(fā)生肺炎、腸炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、心包炎、結(jié)膜炎，公豬發(fā)生睪丸炎等為主要特征。

目前研究表明國內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)殖場中動(dòng)物的衣原體抗體陽性率較高，造成了極大地經(jīng)濟(jì)損失。近幾年來我國從國外引進(jìn)了大量的優(yōu)良動(dòng)物品種，極大地促進(jìn)我國畜牧業(yè)的發(fā)展和提高了人民生活水平。為了探明引進(jìn)種用動(dòng)物中衣原體感染情況，本研究針對河北省2011—2012年間引進(jìn)的2批進(jìn)境種雞、2批進(jìn)境種鴨及2批進(jìn)境種豬血清樣品，通過間接血凝試驗(yàn)對衣原體抗體水平進(jìn)行了檢測。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 待檢材料

隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)室-20℃冷藏保存的進(jìn)境種豬血清90份，種鴨血清48份，種雞血清72份。樣品無菌采集，且未溶血、未腐敗。

1.2 診斷試劑盒和試劑

衣原體間接血凝抗原、陰、陽性血清（批號均為120215）、稀釋液（批號為120320），購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 主要儀器設(shè)備和器材

96孔V型微量反應(yīng)板，25 μL、100 μL微量移液器，微量振蕩器，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，高壓消毒器，臺式離心機(jī)，1.5 μL離心管。

1.4 操作方法與結(jié)果判定

IHA操作方法：用定量加樣器每孔加稀釋液75μL。取25 μL 待檢血清以4 倍遞增稀釋，從第一孔稀釋至第三孔，即1:4、1:16、1:64，第三孔棄去25 μL，孔內(nèi)液體量為75 μL。同一板上同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對照各2 孔。向每孔加抗原各25 μL，置微型振蕩器上振蕩2 min，在37 ℃下作用2 h后判定結(jié)果。

IHA結(jié)果判定：“++++”表示100%凝集紅細(xì)胞全部凝集，形成一層均勻的膜，布滿整個(gè)孔底；“+++”表示75%凝集紅細(xì)胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者稍??；“++”表示50%凝集紅細(xì)胞在孔底形成薄層凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀；“+”表示25%凝集紅細(xì)胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圓點(diǎn)；“-”表示紅細(xì)胞完全沉于孔底，呈光滑的圓點(diǎn)。對照各孔均成立即：陽性血清孔呈“+ + + +”；陰性血清孔呈“-”；空白對照孔呈“-”。被檢血清判定標(biāo)準(zhǔn)：被檢血清1:16孔出現(xiàn)“++”以上者為陽性；1:4孔出現(xiàn)“+”以下者為陰性；1:4孔“++”至1:16孔“+”以下者為可疑。

2 結(jié)果與分析

2.1 IHA檢測結(jié)果

對210份抽檢血清采用IHA檢測衣原體抗體，結(jié)果表明陽性樣品為33份，抗體陽性率為15.7%（表1）。

表1 血清IHA檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同動(dòng)物IHA檢測結(jié)果

由表1 可知，不同動(dòng)物血清樣品中均可檢出衣原體抗體。其中豬抗體陽性率最高，為20%，而鴨抗體陽性率最低，為4.2%。

3 討論

3.1 目前檢測衣原體抗體的方法主要有間接血凝試驗(yàn)（IHA）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和ELISA方法。目前國內(nèi)動(dòng)物衣原體抗體檢測主要依賴間接血凝試驗(yàn)（IHA），該方法操作簡單，不需要專門的儀器設(shè)備，在基層有著廣泛的應(yīng)用。但是該方法重復(fù)性較差，存在一定的假陽性。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）繁瑣費(fèi)時(shí)的操作、結(jié)果重復(fù)性不高、具有極高的技術(shù)要求，該方法非常不利于推廣應(yīng)用。間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）試劑昂貴，同時(shí)需要熒光顯微鏡和操作人員的豐富經(jīng)驗(yàn)，很難推廣使用。目前ELISA方法要比上述幾種方法更加穩(wěn)定、敏感、特異性更強(qiáng)，但是均為國外生產(chǎn)，價(jià)格昂貴。如以色列Biogal公司的ImmunoComb診斷試劑卡，操作方便，但是每份樣品成本為120元，十分不利于大規(guī)模的檢測。目前急需國內(nèi)的衣原體ELISA檢測試劑盒的商品化。

3.2 國內(nèi)邱昌慶等通過間接血凝試驗(yàn)（IHA）對動(dòng)物群中衣原體感染情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明家禽血清陽性率為24.9%，豬血清陽性率為46.8%，奶牛為21.4%，水牛為14.0%～20.0%，黃牛為15.2%～32.6%，牦牛為18.7%，并且不同地區(qū)衣原體抗體陽性率有著明顯的差異。對于我國不同地區(qū)進(jìn)境動(dòng)物的衣原體感染情況，目前的報(bào)道還較少。本研究中我們共檢測了6批3種不同動(dòng)物共210份血清。結(jié)果表明3種動(dòng)物血清樣品中均有陽性檢出，提示目前引入的種用動(dòng)物攜帶該病的機(jī)率很大。由于檢測的范圍和數(shù)量有限，本研究結(jié)果尚不能真正反映出引入種用動(dòng)物感染本病的全貌。本研究涉及的檢測對象沒有包括目前引進(jìn)量較大的奶牛，為了更加真實(shí)、全面的反映引進(jìn)動(dòng)物衣原體感染情況，我們下一步將進(jìn)一步擴(kuò)大檢測范圍及數(shù)量。

[1]楊宜生，姜天童，方雨鈴，等. 衣原體和衣原體病[M]. 武漢：湖北科技出版社，1994.

[2]Kauffold J，Melzer F，Henning K，et al. Prevalence of chla?mydiae in boars and semen used for artif i cial insemination[J].Theriogenology，2006，65（9）：1750-1758.

[3]Zhong G. Killing me softly：Chlamydial use of proteolysisfor evading host defenses[J]. Trends Microbiol，2009，17（10）：467-474.

[4]陸承平，陳杖榴. 獸醫(yī)法規(guī)導(dǎo)論[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：232.

[5]林穎，曹慶炎，孟祥勇. 禽衣原體病綜述[J]. 遼寧畜牧獸醫(yī)，2004（5）：40-42.

[6]邱昌慶.衣原體分類研究進(jìn)展[J]，中國獸醫(yī)科技，2000，30（12）：19-21.