磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

徐長亮 綜述 劉志紅 審校

在對疾病發(fā)病機(jī)制、診斷、生理功能及藥物開發(fā)研究中，往往需要獲取一些高通量、大樣本、全局性數(shù)據(jù)，通過整體化系統(tǒng)性分析，從中尋找線索，推斷可能的病因以及診斷靶標(biāo)，由此誕生了諸如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等建立在網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)式研究思路基礎(chǔ)上多種新的研究方法和理論。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，以其研究對象特殊性、研究方法專業(yè)性及研究思路系統(tǒng)性，已在生命科學(xué)的多個領(lǐng)域和層面發(fā)揮獨特作用。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究尚處于初期階段，鑒于其特殊的研究方法及內(nèi)容，對揭示生命體尤其是疾病狀態(tài)下細(xì)胞信號傳導(dǎo)具有不可替代的優(yōu)勢［1－4］。此外，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為尋找藥物新的作用靶點和疾病診斷指標(biāo)提供全新的研究思路。本文主要就磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)、藥學(xué)及醫(yī)學(xué)研究前景進(jìn)行綜述。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)概述

磷酸化是細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后最重要修飾形式之一，由蛋白激酶及磷酸酶參與，通過對蛋白底物可逆性磷酸化及去磷酸化調(diào)控生理過程，該過程高度保守。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的科學(xué)，包括氨基酸殘基磷酸化程度及細(xì)胞受刺激后動態(tài)的蛋白磷酸化事件。蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵性調(diào)控機(jī)制，幾乎參與細(xì)胞所有的生物學(xué)事件及細(xì)胞調(diào)控過程(如細(xì)胞周期、受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增生、細(xì)胞代謝等)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)正是利用電泳技術(shù)和質(zhì)譜相結(jié)合的手段實現(xiàn)對整個細(xì)胞中磷酸化蛋白的磷酸化程度進(jìn)行監(jiān)控的一種研究方法。

在信號傳導(dǎo)過程中，蛋白質(zhì)磷酸化通常扮演信號級聯(lián)開關(guān)的角色。一方面，受體蛋白酪氨酸激酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可啟動時間依賴性細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化，該過程對其他銜接蛋白或者其他信號分子如蛋白激酶和磷酸化酶重新修飾，將信號傳導(dǎo)至下一級信號分子［5－8］。另一方面，蛋白磷酸化對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的衰減和終止同樣起重要作用，該控制系統(tǒng)失衡可能導(dǎo)致腎臟、心血管、自身免疫等多種疾病和腫瘤［9，10］。

盡管可用磷酸化位點特異性抗體通過普通或二維凝膠電泳檢測蛋白磷酸化，但識別新的磷酸化蛋白，尤其是尋找新磷酸化位點的過程更具挑戰(zhàn)性。除了檢測磷酸化豐度及位點，定量動態(tài)地研究磷酸化事件對于認(rèn)識細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也極其重要。另外，精密調(diào)控激酶和磷酸酶活性可導(dǎo)致相關(guān)信號蛋白磷酸化水平發(fā)生微妙變化。某些信號蛋白的磷酸化不僅存在動態(tài)變化，而且在細(xì)胞中還呈空間分布特點。與此同時，細(xì)胞內(nèi)某些信號傳導(dǎo)蛋白磷酸化程度更多取決于外界刺激，如信號分子、藥物和機(jī)械壓力等。

因而，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)通過系統(tǒng)的回溯性研究，更加準(zhǔn)確和快速尋找激酶或磷酸化酶的源頭作用，然后結(jié)合經(jīng)典的生物學(xué)方法進(jìn)行驗證，快捷地探索各種未知的生命奧秘。與此同時，隨著其他基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展與進(jìn)步，新技術(shù)、新儀器的不斷使用，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究也朝著更具特異性、再現(xiàn)性、重復(fù)性、靈敏性及精確性的方向發(fā)展［11］。

生物學(xué)領(lǐng)域

圖1 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展趨勢［13］

圖2 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

蛋白磷酸化在生命各個環(huán)節(jié)甚至在整個生命科學(xué)均起重要作用。截至2012年7月，Pubmed收錄關(guān)于磷酸化的文獻(xiàn)已經(jīng)超過16萬篇，其中絕大多數(shù)涉及蛋白磷酸化。由于蛋白磷酸化研究的重要性，出現(xiàn)了跳出傳統(tǒng)經(jīng)典生物學(xué)，引申自“鳥槍法”為研究思路的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，是一種基于全細(xì)胞內(nèi)蛋白為研究靶標(biāo)，全蛋白水平掃描不同蛋白的磷酸化程度，尋找新的磷酸化蛋白及新磷酸化位點，不斷完善蛋白磷酸化體系，具有全面、可靠、高效及探索性的特點。首先，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)以整個細(xì)胞所有蛋白為研究對象，研究內(nèi)容囊括了細(xì)胞內(nèi)所有具有生命功能的蛋白，如細(xì)胞增生、細(xì)胞周期、有絲分裂、細(xì)胞分化等所有相關(guān)蛋白，因而研究更為全面。其次，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究基于全蛋白水平，因此其結(jié)果更具普遍性，而經(jīng)典生物學(xué)研究蛋白磷酸化往往針對特定條件，以兩個或多個蛋白之間的相互作用為出發(fā)點，具有相當(dāng)局限性，缺乏整體認(rèn)識，而磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)可一次性全面檢測不同蛋白激酶及磷酸化酶對同一個蛋白磷酸化程度的影響，因而結(jié)果更加可靠。再則，一次蛋白質(zhì)組學(xué)試驗可同時考慮蛋白磷酸化相關(guān)多個變量，了解同一時刻整個系統(tǒng)的變化。經(jīng)典生物學(xué)方法則只是了解單個研究變量(即目的變量)，不能反映細(xì)胞內(nèi)真實情況，逐步增加研究變量并借助更加復(fù)雜的研究系統(tǒng)，從而增加了研究的復(fù)雜性及不確定性，缺乏可重復(fù)性和真實性。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)反映的是細(xì)胞內(nèi)真實發(fā)生的事件，在一次試驗中考慮了各種變量，克服了經(jīng)典生物學(xué)中逐步添加變量的缺陷，更為高效。最后，由于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)為研究對象，更易發(fā)現(xiàn)未知的新磷酸化位點及磷酸化蛋白。另外，結(jié)合經(jīng)典細(xì)胞生物學(xué)的知識，剔除已知蛋白激酶或者磷酸化酶影響，可發(fā)現(xiàn)新的具有磷酸化或去磷酸化功能的酶。

藥學(xué)領(lǐng)域

古人云“一石激起千層浪”，藥物就類似一塊石頭，當(dāng)其進(jìn)入體內(nèi)或作用于細(xì)胞后，其產(chǎn)生的各種生理效應(yīng)，就像“千層浪”一般，擴(kuò)散至整個細(xì)胞甚至全身。如何找到藥物的作用機(jī)制，解答這種具有系統(tǒng)復(fù)雜性的問題，經(jīng)典實驗生物學(xué)方法往往是從某個點出發(fā)，然后通過不同的技術(shù)手段，不同的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，不同的細(xì)胞生理活動，希望通過還原論的觀點，以線性聯(lián)系，一步步推導(dǎo)出藥物作用的靶點，闡述藥物作用的機(jī)制［12］。由于各學(xué)科不斷發(fā)展，雖然產(chǎn)生了諸如分子模擬、同位素標(biāo)記、親和層析等新技術(shù)，以初步篩選、縮小研究范圍，但往往以點代面，必然會導(dǎo)致許多假陽性或者假陰性結(jié)果。因而，就需要一種新的試驗方法，全局性的觀察新問題。由此，便產(chǎn)生了一門新的藥理學(xué)科——網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)被廣泛的用于識別潛在的藥物靶點、預(yù)測其未知的適用范圍甚至檢測某些毒副反應(yīng)。適用范圍較傳統(tǒng)藥理學(xué)更大。由于蛋白的磷酸化在細(xì)胞生理功能及信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控中極其重要，目前許多藥物靶目標(biāo)都是與蛋白磷酸化相關(guān)的酶類，因此很多藥物的作用靶點都是這一類酶。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，由于其全蛋白質(zhì)組水平的磷酸化位點檢測的“網(wǎng)絡(luò)研究”特點，因此克服了傳統(tǒng)還原論“線性研究”缺陷，并結(jié)合已知的細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的知識，可更加快捷準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)藥物作用的潛在靶點，甚至做多靶點的預(yù)測，將更好地揭示藥物作用機(jī)制［13－15］。因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)由于其自身的特點，必將成為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的一種重要的研究手段。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

隨著社會的進(jìn)步，人們對生活質(zhì)量的追求也越來越高，需要威脅生命健康的各種疾病有更多更全面的認(rèn)識。隨著醫(yī)療理念的進(jìn)步，從傳統(tǒng)的重治療輕預(yù)防轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)防治療并重。隨著預(yù)防醫(yī)學(xué)的發(fā)展和完善，不同疾病的早期生物靶標(biāo)的尋找及鑒定已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)工作的重要任務(wù)。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對疾病生物靶標(biāo)，尤其磷酸化蛋白的生物靶標(biāo)的尋找具有不可替代的優(yōu)勢［16－23］。在各種疾病發(fā)病過程及藥物研究中起重要作用。因此，通過比較患者和正常人組織細(xì)胞代謝物中不同的蛋白磷酸化豐度，對于篩選疾病的診斷標(biāo)志物或者預(yù)后標(biāo)志物具有相當(dāng)重要的價值。同時，由于蛋白磷酸化是一個高度動態(tài)的過程，其對疾病治療藥物的使用也非常敏感，在個體化醫(yī)療的不斷發(fā)展與完善，對患者的磷酸化蛋白的研究可以更好的指導(dǎo)臨床醫(yī)生對臨床用藥的選擇。

目前，在腎臟病領(lǐng)域，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)取得長足的發(fā)展，對于研究各種激素及細(xì)胞因子對腎臟功能的改變發(fā)揮重要的推動作用。例如，通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究加壓素對髓袢升支粗段細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及集合管功能的影響［24－30］。另外也有研究涉及血管緊張素Ⅱ及轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF－β)所導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞功能及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［31－35］。同時，由于腎臟疾病可通過尿液監(jiān)測，因此Gonzales等［36］通過尿液外泌體磷酸化蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，多個新的蛋白磷酸化位點，其中包括噻嗪敏感性鈉氯共轉(zhuǎn)運體(NCC)serine－811的磷酸化位點這一個潛在生物靶標(biāo)。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白2(AQP2)的serine－256的磷酸化位點，而通過對該位點的磷酸化程度的檢測，可評估加壓素的活性程度，進(jìn)而監(jiān)測疾病的進(jìn)程［37］。

因而，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對疾病生物靶標(biāo)的尋找，個性化治療方案的制定以及疾病進(jìn)展的監(jiān)測必將發(fā)揮更加重要的作用。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)存在的問題

蛋白磷酸化在細(xì)胞內(nèi)通信中發(fā)揮極其重要生理功能，并在生命信號網(wǎng)絡(luò)中起著信號傳導(dǎo)級聯(lián)放大的作用。參與細(xì)胞中多種生理過程，如細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞新陳代謝，細(xì)胞與細(xì)胞間的交流與溝通，并作出適當(dāng)反應(yīng)，對了解和監(jiān)控蛋白磷酸化意義重大。因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)便順理成章的成為研究蛋白磷酸化最強(qiáng)有力的武器。由于磷酸化蛋白在生理活動中所處的重要的地位，決定了磷酸化蛋白的豐度相對不足。為了解決這個問題需要從兩方面考慮:一是，提高儀器自身的靈敏度;二是，富集磷酸化蛋白。目前設(shè)備的功能尚不能滿足對生物樣本中極微量磷酸化蛋白分析的要求。因此，富集磷酸化蛋白肽段或體液樣品的就顯得尤為關(guān)鍵。目前，已經(jīng)有多種磷酸化蛋白富集方法，但都有不足之處。例如，特異性蛋白抗體免疫沉淀法，由于所用抗體對絲氨酸、蘇氨酸特異性較差，目前主要用于檢測酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。又如，固定金屬親和色譜層析法，雖然克服了免疫沉淀法的部分缺點，但可能會丟失一些低豐度未結(jié)合到層析柱的磷酸化肽段，但對多磷酸化的蛋白由于具有較強(qiáng)的親和力的蛋白卻很難被洗脫下來，同時柱上也會結(jié)合某些酸性基團(tuán)、電子供體也會結(jié)合到柱上，造成非磷酸化的污染。

另外，由于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是基于質(zhì)譜的研究，因而磷酸化肽段的序列分析和磷酸化位點的精確定位成為該研究的一個難點，因為磷酸化肽段與非磷酸化肽段在質(zhì)譜分析中先有不同的碎裂性。常規(guī)的數(shù)據(jù)分析處理軟件主要針對非修飾肽段進(jìn)行研究，當(dāng)使用于磷酸化肽段進(jìn)行處理時，其對序列分析的準(zhǔn)確性、靈敏度以及磷酸化位點鑒定的準(zhǔn)確性都具有很大的局限性。

最后，由于儀器、試劑和樣品的特殊性，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究要求消耗巨大的經(jīng)費和資源。由于磷酸化蛋白在細(xì)胞總蛋白中的豐度較低，只占總蛋白的10%的樣品來源相對較難。因此每次實驗樣本，需要提取大量的蛋白，一方面增加了實驗本身的系統(tǒng)誤差;另一方面也增加了人力消耗。其次，磷酸化蛋白的標(biāo)記成本較高，由于目前廣泛使用的iTRAQ法靈敏度高，但是該法所需要的試劑價格昂貴。另外，為了保證盡量覆蓋所有蛋白譜，往往需要根據(jù)電荷情況將磷酸化蛋白樣品重新分布，而每一個組分都要作為一個單獨樣品，單獨標(biāo)記，進(jìn)一步增加了研究的經(jīng)費投入。

小結(jié):磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究處于初級階段，尚有諸多不足之處，但是隨著研究的不斷開展，實驗技術(shù)的不斷成熟，儀器設(shè)備不斷更新，我們有理由相信磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)必將在未來的生命科學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

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