大白菜GIF蛋白家族的生物信息學(xué)分析

王鳳德 李利斌 李化銀 劉立峰 高建偉

摘要：GIF(GRF-interactingfactor)家族是一類含有sNH和QG結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，可與GRF(Growth reg-ulating factor)轉(zhuǎn)錄因子蛋白相結(jié)合形成功能復(fù)合體，通過(guò)促進(jìn)和維持細(xì)胞的分裂能力參與調(diào)控植物葉器官的發(fā)育。本研究系統(tǒng)鑒定了5個(gè)大白菜的GIF基因，并對(duì)這些基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了保守性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，最后對(duì)BrGIF1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，所有的大白菜和擬南芥GIF蛋白家族成員都具有高度保守的sNH和QG結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化上，G1F蛋白家族可分為兩個(gè)不同的亞家族，并且這種特征在大白菜和擬南芥分離之前就已經(jīng)形成。在表達(dá)模式上，BrGIF1基因在具有較大葉球的菜自交系及具有較強(qiáng)細(xì)胞分裂能力的組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高。另外，BrGIF1基因的表達(dá)受到NAA的誘導(dǎo)和ABA的抑制。這些結(jié)果表明大白菜GIF蛋白可能具有和擬南芥GIF蛋白相似的生物學(xué)功能，在調(diào)控植物器官發(fā)育中具有重要作用。

關(guān)鍵詞：大白菜；GIF蛋白；基因家族；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：100－4942(2012)01－0001－06

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中國(guó)，是我國(guó)乃至世界性的重要蔬菜作物之一。葉球是大白菜食用的最主要器官，其大小是目前開展大白菜育種工作所要考慮的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀。多年的生產(chǎn)實(shí)踐表明，大白菜葉球的大小受嚴(yán)格的遺傳控制，受相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。開展大白菜葉球大小相關(guān)基因的研究對(duì)于從遺傳上控制葉球的大小，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

GIF(GRF—interacting factor)蛋白是植物體內(nèi)一類轉(zhuǎn)錄共激活因子，在功能上與人類SYT轉(zhuǎn)錄共激活因子同源，同屬于SSXT超家族基因。在蛋白結(jié)構(gòu)上，GIF和SYT蛋白都具有明顯的N-末端SNH結(jié)構(gòu)域，但在C-末端二者稍有差別，SYT蛋白在C-末端QPGY結(jié)構(gòu)域富含Gln、Pro、Gly和Tyr氨基酸殘基，而GIF僅富含Gln和Gly氨基酸殘基，因此GIF蛋白的C-末端被稱為QG結(jié)構(gòu)域。已有的研究表明，擬南芥中GIF蛋白家族由3個(gè)成員組成，即AtGIF1、AtGIF2、At-GIF3。在這3個(gè)成員中，AtGIF1是發(fā)現(xiàn)最早也是研究的比較多的一個(gè)基因，其N-末端區(qū)的SNH結(jié)構(gòu)域可與GRF(Growth regulating factor)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成功能復(fù)合體，通過(guò)促進(jìn)和維持細(xì)胞的分裂能力達(dá)到調(diào)控植物器官大小的目的。例如，AtGIF1基因功能缺失突變體由于葉細(xì)胞數(shù)目減少而使得葉片變小、變窄，而過(guò)量表達(dá)AtGIF1基因的擬南芥植株由于葉細(xì)胞數(shù)目增多則表現(xiàn)出葉器官增大的表型。此外，近年的研究發(fā)現(xiàn)，AtGIF2和AtGIF3基因具有與AtGIF1基因類似的生物學(xué)功能，在調(diào)控植物細(xì)胞分裂能力中也具有重要的作用。

雖然GIF基因的功能在擬南芥中已經(jīng)有所研究，但GIF蛋白在不同物種間是否具有類似的調(diào)控功能尚不得而知。在本研究中，筆者對(duì)同屬十字花科的大白菜GIF蛋白家族成員進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，并對(duì)BrGIF1基因在大白菜中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，以期為揭示GIF蛋白在不同物種間的生物學(xué)功能提供依據(jù)，同時(shí)也為下一步利用基因工程手段提高大白菜產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料培養(yǎng)與處理

供試大白菜自交系：Brap-197、Brap-210、Brap-251、Brap-254、Brap-271、 Brap-272、Brap-262、Brap-310、Brap-317、Brap-340為本實(shí)驗(yàn)室自有，挑選籽粒飽滿的種子按濟(jì)南地區(qū)正常播種期播種在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)田內(nèi)。

大白菜包葉組織收集及葉球大小統(tǒng)計(jì)：待大白菜結(jié)球期剛剛開始(心葉開始卷曲)時(shí)切取卷曲的心葉(包葉)；待大白菜葉球停止生長(zhǎng)(休眠期)時(shí)對(duì)葉球鮮重和最外層球葉大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

大白菜不同組織材料收集：待大白菜(Brap-197)長(zhǎng)到23～25葉(心葉開始卷曲)時(shí)，分別切取包葉、完全展開的蓮座葉、根尖以及短縮莖。

NAA和ABA處理材料收集：將種子(Brap-197)消毒后，28℃、光照16h/黑暗8h周期下，培養(yǎng)皿(墊兩層濾紙)中培養(yǎng)8天，然后用5μmol/LNAA、50μmol/L ABA或者蒸餾水(DW)對(duì)大白菜幼苗進(jìn)行噴霧處理，以葉片上附著細(xì)密水珠但不流淌為宜，分別于處理后0、1、3、6、9、12h收集處理葉。

1.2大白菜GIF家族成員搜索

利用已報(bào)道的擬南芥GIF蛋白家族成員基因(表1)，通過(guò)Blastn程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索相似的基因序列，然后利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)其編碼氨基酸序列。將預(yù)測(cè)的編碼氨基酸序列通過(guò)Blastp程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，若屬于SSXT超家族，則認(rèn)為其屬于大白菜GIF蛋白家族成員。

1.3序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用DNAMAN軟件，對(duì)大白菜GIF蛋白家族的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。使用MEGA4.0對(duì)大白菜和擬南芥中GIF蛋白家族成員做系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用Boot-strap Test-Neighbor Joining方法，重復(fù)1000次運(yùn)算。

1.4表達(dá)模式分析

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別采用Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國(guó))和cDNA第一鏈合成試劑盒(Takara，日本)，步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)使用IQ5實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))和SYBRGreen Master Mix試劑(Takara，日本)。RT- qPCR引物采用Primer Express 2.0軟件(AppliedBiosytems，美國(guó))設(shè)計(jì)，BrGIF1引物為：BrGIF1-F：5'-ATGCAACAGCACCTGATGCAGATG-3'和BrGIF1-R：5'-TCAGTTCCCATCATCTGAT-GACTT-3'。RT-qPCR反應(yīng)體系為20μl，引物終濃度為0.25μmol/L，模板為2μl稀釋10倍后的cDNA。反應(yīng)采用兩步法進(jìn)行：95℃ 1.5min；然后95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，并在全部循環(huán)結(jié)束后制作融解曲線，檢測(cè)是否有引物二聚體生成。大白菜Actin基因(引物為Actin-F：5'-GCTTACGTCGCTCTTGACTACG-3'和actin-R：5'-GATGGTGATGACTTGTCCATCAG-3')作為內(nèi)參，以cDNA0倍濃度梯度稀釋溶液作為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。并且以未反轉(zhuǎn)錄

RNA樣品作為對(duì)照，防止DNA污染。

2.結(jié)果與分析

2.1大白菜和擬南芥GIF家族蛋白的保守序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)各種Blast搜索和比對(duì)，從現(xiàn)有的大白菜基因組數(shù)據(jù)中鑒定出5個(gè)GIF蛋白家族基因(表1)，分別命名為BrGIF1～BrGIF5(其中BrGIF1～BrGIF4為EST序列，BrGIF5為基因組序列)，這些結(jié)果說(shuō)明大白菜基因組中至少存在5個(gè)GIF蛋白家族基因。比擬南芥具有更多GIF基因的原因可能與大白菜基因組比擬南芥的復(fù)雜有關(guān)。為了確定植物中GIF蛋白的序列特征，用DNAMAN軟件對(duì)5個(gè)大白菜的和3個(gè)擬南芥的GIF蛋白家族的氨基酸全序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明供試序列之間存在較高的同源性，都具有兩個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域，即位于N-末端的SNH結(jié)構(gòu)域和位于C-末端的富含Gln和G]y的QG結(jié)構(gòu)域(圖1)，這說(shuō)明供試蛋白之間在生物學(xué)功能上可能具有相似性。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)分析，可將大白菜和擬南芥中的GIF蛋白分成I和Ⅱ兩個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族都包含幾個(gè)大白菜和擬南芥的GIF基因，表明這一基因家族的基本特征在大白菜和擬南芥分離之前就已經(jīng)形成，但是GIF蛋白在這兩組中的進(jìn)化關(guān)系各不相同，如在I組中的BrGlF1和BrGIF4和Ⅱ組中的BrGIF2和BrGIF3表現(xiàn)為旁系同源關(guān)系。在I組中的AtGIF1和BrGIFl、BrGIF4、BrGIF5之間，以及Ⅱ組中的AtGIF2與

BrGIF2、BrGIF3之間可以歸類為直系同源進(jìn)化基因，它們?cè)诖蟀撞撕蛿M南芥中可能具有相似的功能。

2.2大白菜BrGIFl基因表達(dá)模式分析

為了全面探索大白菜GIF蛋白在調(diào)控植物器官大小中的作用，采用RT-qPCR方法，以大白菜肌動(dòng)蛋白基因Actin為基因表達(dá)內(nèi)部參照，對(duì)大白菜BrGIF1基因在結(jié)球初期不同品種大白菜包葉中的表達(dá)，結(jié)球初期大白菜根、莖、蓮座葉和包葉中的表達(dá)以及受NAA和ABA處理后的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果(圖3、圖4、圖5)表明，在結(jié)球初期的包葉中，葉球較大的品種具有較高的Br-GIF1轉(zhuǎn)錄水平，例如Brap-197與Brap-251相比，前者葉球的重量約是后者的10.4倍；而Br-GIF1在結(jié)球初期包葉中的表達(dá)量前者約是后者的34.6倍，這表明BrGIF1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與大白菜的葉球大小之間具有密切的相關(guān)性。

對(duì)BrGIF1在結(jié)球初期不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BrGIF1在包葉中表達(dá)量最高，其次為根尖，再次為蓮座葉，莖中的表達(dá)量最低(圖6)。

在培養(yǎng)8天的大白菜幼苗中，NAA和ABA處理對(duì)BrGIF1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響存在顯著差異(圖7)。NAA處理后1h BrGIF1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平達(dá)到一個(gè)相對(duì)較高的水平，6h時(shí)與DW處理的表達(dá)水平類似，6h后BrGIF1的表達(dá)量在檢測(cè)時(shí)限內(nèi)一直處于上升趨勢(shì)。而ABA處理后Br-GIF1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到抑制，在6h時(shí)達(dá)到最低水平，然后表達(dá)水平開始恢復(fù)，并在12h時(shí)達(dá)到與DW處理類似的水平。在整個(gè)處理期間，DW對(duì)BrGIF1的表達(dá)無(wú)明顯影響。這說(shuō)明NAA處理能誘導(dǎo)BrGIF1的表達(dá)，而ABA處理則抑制BrGIF1的表達(dá)。

3.結(jié)論與討論

本研究利用比較基因組學(xué)的方法，以擬南芥GIF蛋白家族基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，從大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到5個(gè)GIF蛋白家族基因。通過(guò)對(duì)擬南芥和大白菜GIF蛋白家族基因的序列保守性和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，大白菜和擬南芥GIF蛋白家族之間存在較高的保守性，尤其在SNH和QG結(jié)構(gòu)域的保守性更為明顯，這種序列上的保守性提示大白菜GIF蛋白和擬南芥GIF蛋白之間可能具有功能上的相似性。

在擬南芥中GIF蛋白調(diào)控植物器官大小的機(jī)制在于促進(jìn)和/或者維持細(xì)胞分裂能力，因此，在具有較強(qiáng)細(xì)胞分裂能力的組織或器官中應(yīng)該具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，例如在擬南芥莖尖和根尖組織可檢測(cè)到AtGIF1具有較高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，而在最上部的莖和成熟葉中的表達(dá)量則相對(duì)較低。

為了進(jìn)一步探索大白菜GIF蛋白家族在調(diào)控植物器官大小中的作用，本研究以BrGIF1為代表，利用RT-qPCR的方法研究了其在大白菜中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，BrGIF1在結(jié)球初期包葉中的表達(dá)水平與大白菜葉球大小之間存在密切的相關(guān)性，即較大葉球具有較高的BrGIF1轉(zhuǎn)錄水平。

BrGIF1在大白菜結(jié)球初期的包葉和根中具有較高的mRNA水平，在蓮座葉和莖中則表達(dá)量較低，這可能與此時(shí)的包葉正處于生長(zhǎng)旺盛期，細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)，而蓮座葉和莖已基本停止生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂能力較弱有關(guān)。

生長(zhǎng)素是植物體內(nèi)的一種重要內(nèi)源激素，在調(diào)控植物細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)中具有重要作用，并已被廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的植株再生。在研究中發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素抗性的擬南芥突變體由于細(xì)胞數(shù)目的減少而使得器官變小。此外，參與調(diào)控植物細(xì)胞分裂的CycD3；1、COKA；1和BrAR-GOS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也受到生長(zhǎng)素的調(diào)控。與生長(zhǎng)素的作用相反，ABA則具有抑制多種植物細(xì)胞有絲分裂的能力。在本研究中，筆者分析了BrGIF1對(duì)外源NAA和ABA處理的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)BrGIF1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可被NAA誘導(dǎo)，被ABA抑制。

本試驗(yàn)較系統(tǒng)地研究了大白菜GIF蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并對(duì)其中的一個(gè)成員BrGIF1基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，這對(duì)進(jìn)一步研究GIF蛋白家族在植物發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用具有重要意義，也為進(jìn)一步利用基因工程手段改良大白菜品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。