巢式PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序檢測(cè)乙肝病毒耐藥基因的方法建立和初步臨床應(yīng)用

劉 玲 李從榮 鄭 毅 趙友云

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(湖北武漢，430060) 2.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科

HBV基因組在復(fù)制過(guò)程中，在經(jīng)過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程中，因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，使病毒基因的復(fù)制過(guò)程中極易發(fā)生核苷酸的錯(cuò)配，因此，HBV是一種變異性極高的病毒。在機(jī)體自身、藥物和病毒的多重作用下，HBV DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性區(qū) (RT區(qū))會(huì)發(fā)生多種耐藥突變［1］。耐藥突變不僅會(huì)降低抗病毒治療的效果，還會(huì)使乙型肝炎進(jìn)一步進(jìn)展、惡化。HBV基因變異及其導(dǎo)致的藥物靶位氨基酸的替代是導(dǎo)致病毒耐藥的基礎(chǔ)，所以對(duì)HBV耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)極具臨床意義。本研究的目的是建立能適用臨床檢測(cè)HBV對(duì)核苷 (酸)類(lèi)似物耐藥突變的巢式PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源 選取223例于2011年8月至2013年2月間在湖北省中醫(yī)院肝病科就診的CHB患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南》［2］，其中192例曾經(jīng)或現(xiàn)在接受核苷(酸)類(lèi)似物治療 (用藥組)，31例此前無(wú)核苷 (酸)類(lèi)似物治療史 (未用藥組)。男176人，女47人;患者年齡 (41±33)歲。

1.2 重組質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)株 HBV B、C型野生標(biāo)準(zhǔn)株由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，定量至2×105copies/ml，作為標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA。HBV標(biāo)準(zhǔn)野生株重組質(zhì)粒(pHBV)873bp包含有 8個(gè)突變位點(diǎn) (rt173L、rt180M、rt181V、rt184G/I/S、rt202I/G、rt204I/V/S、rt236T、rt250V/L)由上海生工生物公司合成。質(zhì)粒由2×105copies/ml逐級(jí)10倍稀釋至2×102copies/ml作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA，對(duì)巢式PCR體系進(jìn)行評(píng)估。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載 A、B、C、D型HBVP基因片段，作為靶基因。針對(duì)其P基因RT區(qū)，在上下游使用Primer Expresx 3.0分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，命名為P引物。引物除須滿足設(shè)計(jì)的基本要求外，還要保證內(nèi)外引物間有50-150bp的距離，并用Blast驗(yàn)證兩對(duì)引物的特異性。第一輪引物命名為P1/P2，第二輪PCR引物命名為P3/P4(見(jiàn)表1)。所有的引物均委托上海生工生物公司合成。

表1 巢式PCR引物序列

1.3.2 HBV DNA提取 患者血液以EDTA抗凝后離心取血漿，按照上海復(fù)星科技有限公司生產(chǎn)的HBV檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取。

1.3.3 巢式PCR反應(yīng)體系及參數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)病毒HBV DNA(濃度為2×105copies/ml且包括B/C型)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(濃度為2×105copies/ml至2×102copies/ml)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA均平行重復(fù)兩次。根據(jù)在同一擴(kuò)增條件下不同反應(yīng)體系擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳條帶效果和PCR速度最快原則來(lái)確定最優(yōu)反應(yīng)體系 (見(jiàn)表2)。

表2 巢式PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.3.4 巢式PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)引物設(shè)計(jì)參數(shù)確定最佳反應(yīng)條件如下:引物P1/P2:第一輪94℃ 6分鐘;94℃ 30秒，60℃ 5秒，74℃ 30秒，40個(gè)循環(huán);74℃ 6分鐘。引物P3/P4:第二輪94℃ 6分鐘;94℃ 30秒，55℃ 5秒，74℃ 26秒，40個(gè)循環(huán);74℃ 6分鐘。

按照表2中的反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果，配制巢式PCR反應(yīng)緩沖液。50μl反應(yīng)體系包含對(duì)應(yīng)濃度的上述試劑和5μl DNA模板。

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 取5.5μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)目的條帶是否存在及其亮度。將產(chǎn)物電泳結(jié)果陽(yáng)性的樣本，送測(cè)序公司，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

1.3.6 測(cè)序結(jié)果的序列比對(duì) 將測(cè)序結(jié)果中，seq格式序列與NCBI上下載的HBV標(biāo)準(zhǔn)野生毒株序列用Mega 4.0進(jìn)行比對(duì)，從而得到巢式PCR反應(yīng)的最低檢測(cè)濃度。將測(cè)序結(jié)果的ab1格式文件，用Chromas軟件對(duì)其中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的測(cè)序情況進(jìn)行分析，檢查是否出現(xiàn)重疊峰，是否發(fā)生突變，驗(yàn)證質(zhì)粒DNA純度及PCR產(chǎn)物的特異性。

1.3.7 臨床樣本的檢測(cè) 對(duì)223例CHB患者進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，同時(shí)以熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)其病毒載量定量。將測(cè)序結(jié)果的 seq格式文件中的序列復(fù)制到 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi可得到HBV分型結(jié)果。將ab1格式文件用Mega 4.0與HBV標(biāo)準(zhǔn)序列片段進(jìn)行比對(duì)可得到HBV耐藥突變結(jié)果。對(duì)用藥組和未用藥組結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)估核苷類(lèi)似物治療對(duì)患者體內(nèi)HBV病毒變異的影響。

2 結(jié)果

2.1 巢式PCR產(chǎn)物檢測(cè)下限 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)巢式PCR技術(shù)，利用兩對(duì)引物成功擴(kuò)增出HBV P基因RT區(qū)長(zhǎng)約755bp，B/C型標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA都能由P引物成功擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA用引物經(jīng)兩輪約4小時(shí)巢式PCR擴(kuò)增后，質(zhì)粒DNA濃度由2×105copies/ml至2×103copies/ml者均在設(shè)計(jì)長(zhǎng)度位置有可見(jiàn)的明亮陽(yáng)性條帶;濃度為2×102copies/ml時(shí)有隱約的可見(jiàn)條帶 (圖1、圖2)，但送測(cè)序后，均顯示反應(yīng)弱，測(cè)序失敗。故初步確定2×103copies/ml為巢式PCR反應(yīng)的檢測(cè)下限。

圖1 質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)HBV巢式PCR產(chǎn)物電泳圖(1～4為2×105copies至2×102copies質(zhì)粒，5、6為B、C型標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA)

圖2 HBV巢式PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 測(cè)序結(jié)果分析及序列比對(duì) 標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果均未出現(xiàn)重疊峰現(xiàn)象，測(cè)序結(jié)果良好，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和污染現(xiàn)象。B/C型標(biāo)準(zhǔn)病毒測(cè)序結(jié)果于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分型均與其對(duì)應(yīng)的型別相符 (圖3)。濃度為2×105copies/ml至 2×103copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果良好，且條帶長(zhǎng)度基本與設(shè)計(jì)相符。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA測(cè)序結(jié)果

2.3 巢式PCR反應(yīng)結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用 利用本巢式PCR反應(yīng)結(jié)合焦磷酸測(cè)序體系，進(jìn)行的臨床應(yīng)用的初步探索，將223例慢性乙肝患者分為用藥組和未用藥組，選取RT中的8個(gè)位點(diǎn) (rt173L、rt180M、rt181V、rt184G/I/S、rt202I/G、rt204I/V/S、rt236T、rt250V/L)作為靶位點(diǎn)分析。所有樣本均能通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，并成功測(cè)序。在用藥組192例中，53例 (27.6%)患者發(fā)生耐藥突變，其中30.1%(16例)發(fā)生204位點(diǎn)突變，產(chǎn)生180位點(diǎn)、181耐藥突變的均為5.6%(3/53)，3.8%(2/53)發(fā)生236位點(diǎn)突變，1.9%(1/53)發(fā)生202位點(diǎn)突變;37.7(20/53)同時(shí)產(chǎn)生180/204位點(diǎn)突變，同時(shí)發(fā)生181/236、204/250位點(diǎn)突變的均為3.8%(2/53);同時(shí)發(fā)生3個(gè)位點(diǎn)突變的占7.5%(173/180/240、180/181/204、180/184/204、180/202/204各1例)。用藥組患者的測(cè)序進(jìn)行基因分型表明153例(79.7%)為B型HBV，39例 (20.3%)為C型HBV。上述突變中，204位點(diǎn)突變往往伴隨著180位點(diǎn)的同時(shí)突變 (24例，占突變患者的45.3%)(圖4)。未用藥組31例中，未發(fā)現(xiàn)耐藥突變的現(xiàn)象，基因分型結(jié)果表明25例 (80.6%)為B型HBV，6例 (19.4%)為C型HBV。

圖4 180、204位點(diǎn)突變測(cè)序結(jié)果(箭頭指示突變堿基)

3 討論

當(dāng)前對(duì)CHB的治療主要是采用核苷 (酸)類(lèi)似物和干擾素進(jìn)行抗病毒治療，核苷 (酸)類(lèi)似物盡管具有強(qiáng)大的HBV DNA抑制作用、能方便地口服給藥、不良反應(yīng)也較干擾素少等優(yōu)點(diǎn)，但選擇其作為首選治療策略的病患須面對(duì)長(zhǎng)期用藥和逐年增高的耐藥風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)實(shí)［1，3～6］。

現(xiàn)階段針對(duì)CHB耐藥的檢測(cè)主要有基因型耐藥和表型耐藥兩種［1，6］。當(dāng)病毒對(duì)某些藥物產(chǎn)生耐藥性時(shí)，病毒基因會(huì)發(fā)生一些明確的突變，且基因型耐藥往往在表型耐藥前1～3個(gè)月出現(xiàn)。因此，在臨床治療過(guò)程中對(duì)HBV進(jìn)行耐藥基因型的檢測(cè)，將有助于幫助醫(yī)生及時(shí)給出或調(diào)整治療方案，延緩或阻止表型耐藥的發(fā)生?；蛐湍退帣z測(cè)方法目前常用的有直接測(cè)序法、限制性片段多態(tài)性分析法、線性探針?lè)聪螂s交、基因芯片法4種。直接測(cè)序法又是其中最為直觀的，且能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)耐藥突變位點(diǎn)。

本研究所建立的巢式PCR結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的HBV耐藥突變檢測(cè)方法中，能對(duì)B/C型HBV DNA進(jìn)行良好的擴(kuò)增、測(cè)序。在對(duì)少量臨床樣本的初步探索中，只檢測(cè)到B型、C型HBV，且B型居多，與湖北地區(qū)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)基本相符［7，8］。研究中針對(duì)拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、恩曲他濱和阿德福韋酯5種核苷 (酸)類(lèi)似物的突變位點(diǎn)檢測(cè)，顯示204位點(diǎn)由野生型的M突變?yōu)閅IDD和YVDD的明顯高于其他位點(diǎn)的突變，且180位點(diǎn)突變往往同時(shí)突變，這可能與臨床上對(duì)拉米夫定和恩替卡韋兩種藥物的大量使用有關(guān)［1，2］。

本檢測(cè)技術(shù)能進(jìn)行HBV多個(gè)耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)，還能同時(shí)進(jìn)行病毒基因分型，為治療藥物的選用、調(diào)整和療效判斷提供重要的依據(jù)。巢式PCR方法不需要特殊的檢測(cè)儀器和昂貴的進(jìn)口試劑，操作簡(jiǎn)單快捷;即使不具備焦磷酸測(cè)序條件的普通臨床實(shí)驗(yàn)室也可聯(lián)合商業(yè)測(cè)序公司完成HBV分型和耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)，適合臨床推廣使用。

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