鴿蛔蟲ITS rDNA的克隆與序列分析

李金平 張浩吉 梁詳解 蒲文珺 李高強 郭建超 李國清

摘要：以采自廣東省佛山市的鴿蛔蟲（Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｃｏｌｕｍｂａｅ）為研究對象，利用保守引物ＢＤ１和ＢＤ２擴增鴿蛔蟲基因組ＤＮＡ的ＩＴＳ ｒＤＮＡ片段，對擴增產(chǎn)物進行克隆和序列測定。結(jié)果成功擴增出大小為１ ０４５ ｂｐ的ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列。獲得的鴿蛔蟲的ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列（ＡＣ００１、ＡＣ００２）的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ與ＧｅｎＢａｎｋ收錄的雞蛔蟲５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＡＪ００１５０８）相似性分別為９５．５％和９４．３％，而與澳大利亞鴿蛔蟲５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＡＪ００１５０９）相似性分別為９６．８％和９５．５％。將獲得的序列與蛔目不同科的代表性蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列進行比對和系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明鴿蛔蟲與雞蛔蟲處于同一進化分支上，也表明ＩＴＳ ｒＤＮＡ是蛔蟲分子鑒定的有效遺傳標記，這對蛔蟲分子分類學(xué)及分子流行病學(xué)的進一步研究打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴿蛔蟲（Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｃｏｌｕｍｂａｅ）；ＩＴＳ ｒＤＮＡ；序列分析；系統(tǒng)進化分析

中圖分類號：Ｓ８５２．７３＋１；Ｑ７８５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－4138-03

Clone and Sequence Analysis of ITS rDNA of Ascaridia columbae

ＬＩ Ｊｉｎ－ｐｉｎｇ1，2，ＺＨＡＮＧ Ｈａｏ－ｊｉ2，ＬＩＡＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｊｉｅ1，ＰＵ Ｗｅｎ－ｊｕｎ2，ＬＩ Ｇａｏ－ｑｉａｎｇ1，ＧＵＯ Ｊｉａｎ－ｃｈａｏ1，ＬＩ Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ1

（１．College of Veterinary Medicine，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒal Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；

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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ） ｒＤＮＡ ｏｆ ｒｏｕｎｄｗｏｒｍ（Ascaridia columbae） ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｆｏｓｈａｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ＢＤ１ ａｎｄ ＢＤ２． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ， ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗed ｔｈａｔ ｔｈｅ ＩＴＳ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ. ｃｏｌｕｍｂａｅ ｗａｓ １ ０４５ ｂｐ． Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ５．８ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ． ｃｏｌｕｍｂａｅ （ＡＣ００１， ＡＣ００２） ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ Ａ． ｇａｌｌｉ （ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ， ＡＪ００１５０８） ｗａｓ ９５．５％ ａｎｄ ９４．３％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ａ． ｃｏｌｕｍｂａｅ （ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ， ＡＪ００１５０９） ｗａｓ ９６．８％ ａｎｄ ９５．５％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５．８Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ａ． ｃｏｌｕｍｂａｅ ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ families ｏｆ Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ａ． ｇａｌｌｉ ａｎｄ Ａ． ｃｏｌｕｍｂａｅ were ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｂｒａｎｃｈ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＩＴＳ ｒＤＮＡ ｗａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ， which ｌａｙｅｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｃｏｌｕｍｂａｅ； ＩＴＳ ｒＤＮＡ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ

鴿蛔蟲（Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｃｏｌｕｍｂａｅ）是禽蛔科禽蛔屬的一種大型線蟲，主要寄生于鴿、孔雀等的小腸，具有較廣泛的地理分布。鴿感染了鴿蛔蟲后的主要癥狀表現(xiàn)為食欲不振、精神沉郁、下痢、消瘦、貧血，直至衰竭死亡。幼鴿易感，成鴿感染后會導(dǎo)致消瘦、飛行力下降，對養(yǎng)鴿業(yè)的危害很大。

傳統(tǒng)的蛔蟲鑒定方法是依據(jù)蟲體進行形態(tài)學(xué)鑒定，此法簡單易行，鑒定成蟲比較準確，但對于蛔蟲的蟲卵和幼蟲，形態(tài)學(xué)鑒定往往具有局限性。近些年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將ＰＣＲ擴增和序列分析技術(shù)相結(jié)合，可以從基因水平揭示物種間的差異和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系［１］。在開展寄生蟲的分子鑒定和分子分類學(xué)研究中，選擇適當?shù)倪z傳標記至關(guān)重要。ＩＴＳ是ｒＤＮＡ中介于１８ Ｓ和２８ Ｓ之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ＩＴＳ１、５．８ Ｓ rDNA和ＩＴＳ２，進化速度快且長度不大，加上協(xié)同進化使該片段在基因組不同單元間十分一致，種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是理想的種間鑒定的遺傳標記，這對于寄生蟲的分子分類學(xué)、分子遺傳學(xué)、種（株）鑒定等方面的研究有重要意義［２，３］。

目前，尚未見到有關(guān)鴿蛔蟲鑒定的報道。為此，本試驗通過對鴿蛔蟲樣品的ＤＮＡ提取，ＩＴＳ rDNA克隆及序列分析，旨在鑒定出鴿蛔蟲的種類，為進一步的分子遺傳學(xué)和分子診斷學(xué)研究以及鴿蛔蟲病的防治打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

鴿蛔蟲采自廣東省佛山市某鴿場，置于體積分數(shù)為７０％的乙醇中保存，Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＥｃｏＲⅠ、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶和ｐＭＤ１８－Ｔ載體均購自寶生物工程（大連）有限公司，蛋白酶Ｋ購自德國默克醫(yī)藥公司，ＵＮＩＱ－１０柱式ＰＣＲ產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，ＤＮＡ抽提試劑盒ＷｉｚａｒｄＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，大腸桿菌ＤＨ５α為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實驗室保存。

１．２方法

１．２．１鴿蛔蟲總ＤＮＡ的提取取單個鴿蛔蟲成蟲的一小段于１．５ ｍＬ離心管中，剪碎并研磨，然后加入２７５ μＬ的ＳＤＳ ＤＮＡ裂解液，混勻后放入微量恒溫器中，于５５ ℃作用１６～１８ ｈ，每隔１～２ ｈ振蕩１次。消化完全后，根據(jù)ＷｉｚａｒｄＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ使用說明，對蟲體懸液進行提取。

１．２．２引物的選擇與合成參照文獻［４－７］選擇能擴增大部分線蟲ＩＴＳ rDNA基因的ＢＤ１和ＢＤ２分別作為上游和下游引物，其中ＢＤ１序列為５′－ＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡ－３′，ＢＤ２序列為５′－ＡＴＧＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴ－３′。上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)期擴增片段大小約１ ０００ ｂｐ。

１．２．３ＩＴＳ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴增向０．２ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中依次加入１０×Ｂｕｆｆｅｒ（不含Ｍｇ２＋）２．５ μＬ、８．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ、２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ２．０ μＬ、２５ ｐｍｏｌ／μＬ ＢＤ１ ０．５ μＬ、２５ ｐｍｏｌ／μＬ ＢＤ２ ０．５ μＬ，５ Ｕ／μＬ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５ μＬ、模板ＤＮＡ ２．０ μＬ，最后補去離子水使ＰＣＲ反應(yīng)體系的總體積為２５ μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)條件：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，５５ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３７個循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物用１％的瓊脂糖凝膠電泳分析。

１．２．４ＩＴＳ ｒＤＮＡ的克隆用ＵＮＩＱ－１０柱式ＰＣＲ產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，將其連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞ＤＨ５α，涂布于含氨芐青霉素的ＬＢ平板上，于３７ ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性菌落進行菌液ＰＣＲ初步鑒定。將陽性菌液送上海博尚生物技術(shù)有限公司進行核苷酸序列測定。

１．２．５序列分析將所測定的序列與ＧｅｎＢａｎｋ中所收錄的相關(guān)序列進行比對。使用ＤＮＡｓｔａｒ Ｖ５．０７的ＥｄｉｔＳｅｑ和Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序進行序列分析，比較其核苷酸序列相似性和遺傳關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上建立系統(tǒng)進化分析圖。

２結(jié)果

２．１鴿蛔蟲ＩＴＳ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴增結(jié)果

將ＰＣＲ產(chǎn)物于１％瓊脂糖凝膠進行電泳，可見大小約１ ０００ ｂｐ的條帶（圖１），與預(yù)期目的片段大小一致。用純化回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物并將之克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞ＤＨ５α，取鴿蛔蟲樣品１、２的白色單菌落進行菌液ＰＣＲ鑒定，均得到大小約１ ０００ ｂｐ的條帶。

２．２序列比對結(jié)果

選取鴿蛔蟲樣品１、２的陽性克隆樣品送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果表明這兩份樣品的ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列大小均為１ ０４５ ｂｐ。將獲得的序列進行ＢＬＡＳＴ分析，結(jié)果表明，其５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列與雞蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＡＪ００１５０８）的相似性分別為95.5％和94.3%，證明此ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列為蛔蟲的。然后利用ＤＮＡｓｔａｒ V５．０７對２個樣品的ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列進行比對，其同源性為９８．７％。

２．３系統(tǒng)進化分析結(jié)果

用ＤＮＡｓｔａｒ V５．０７將測序所得的鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ（ＡＣ００１、ＡＣ００２）與ＧｅｎＢａｎｋ收錄的其他蛔蟲的相應(yīng)序列進行比較分析，結(jié)果見圖２和圖３。

從圖２和圖３可知，從廣東省佛山市分離的鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ（ＡＣ００１、ＡＣ００２）序列和ＧｅｎＢａｎｋ中所收錄的澳大利亞鴿蛔蟲、豬蛔蟲、牛新蛔蟲、人蛔蟲、澳大利亞雞蛔蟲、簡單異尖線蟲、犬弓首蛔蟲、貓弓首蛔蟲和獅弓蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列存在著不同程度的差異。其中，從廣東省佛山市分離的鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列（ＡＣ００１、ＡＣ００２）與澳大利亞鴿蛔蟲５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＡＪ００１５０９）處于并列位置，相似性分別為９６．８％和９５．５％，而與澳大利亞雞蛔蟲５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＡＪ００１５０８）相似性分別為９５．５％和９４．３％，因此可以說ＡＣ００１、ＡＣ００２與ＡＪ００１５０９同源性較高，所以可以推斷鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列非常保守，但還是存在著國家或地區(qū)上的地理差異。

３討論

隨著生物種群的不斷進化和發(fā)展，寄生蟲的形態(tài)學(xué)鑒定越來越顯出它的局限性，尤其對那些相似種或近緣種來說，從形態(tài)上很難進行區(qū)分，這時就需要采用其他方法來對寄生蟲進行分類和鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用ＰＣＲ方法對寄生蟲某段具有種特異性的ＤＮＡ進行序列分析成為寄生蟲分類和鑒定的必要手段。ＩＴＳ是ｒＤＮＡ中介于１８ Ｓ和２８ Ｓ之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ＩＴＳ１和ＩＴＳ２兩段序列，在種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異。而在生物進化過程中１８ Ｓ、５．８ Ｓ和２８ Ｓ ｒＤＮＡ具有種內(nèi)高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是理想的種間鑒定的遺傳標記［８－１１］。以ＩＴＳ為遺傳標記進行ＰＣＲ擴增與序列比較已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種寄生蟲的分子水平的鑒定及分類。

因此試驗也采用ＰＣＲ擴增鴿蛔蟲ＩＴＳ ｒＤＮＡ并進行序列分析，從而對鴿蛔蟲的分子鑒定和分子分類進行研究。由于ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫對于鴿蛔蟲的ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列暫時還沒有報道，因此本試驗未對ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列做進化分析。而將鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ（ＡＣ００１、ＡＣ００２）序列與ＡＪ００１５０９序列進行了比較，結(jié)果表明，澳大利亞鴿體內(nèi)的鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ序列和廣東省佛山市鴿體內(nèi)鴿蛔蟲的５．８ Ｓ ｒＤＮＡ有較高的同源性（分別為９６．８％和９５．５％），但還是存在著國家或地區(qū)上的地理差異。該研究為鴿蛔蟲分類、鑒定和遺傳變異的進一步研究打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯田宇曦）

收稿日期：２０１１－１１－２１

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金項目（１０１５２８００００１０００００７）

作者簡介：李金平（１９８４－），女，廣東茂名人，碩士，研究方向為預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，（電話）１５８８９９６７０１４（電子信箱）ｌｉｊｉｎｐｉｎｇ２００７＠１２６．ｃｏｍ；

通訊作者，張浩吉，教授，（電話）１３９２９９６４８６９（電子信箱）ｚｈａｎｇｈａｏｊｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。