VEGF—C在NSCLC中的表達(dá)及其臨床意義

張波　朱佳妮　 陳保富　章霞　葉敏華　朱成楚

[摘要] 目的 血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）傾向于擴(kuò)散至淋巴系統(tǒng)，被認(rèn)為是最具特異性的淋巴管生成調(diào)控因子。本研究旨在探討VEGF-C在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義。 方法 采用免疫組化檢測70例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中VEGF-C的表達(dá)，以癌旁組織19例、正常肺組織20例為對照。 結(jié)果 VEGF-C在NSCLC中的陽性表達(dá)率為78.6%，明顯高于在癌旁組織和正常肺組織的表達(dá)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的肺癌標(biāo)本中VEGF-C陽性表達(dá)率明顯高于在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組肺癌中表達(dá)率；低分化組的肺癌標(biāo)本中VEGF-C陽性表達(dá)率高于在中高分化組中表達(dá)率。Logistic回歸分析顯示腫瘤組織分化程度是VEGF-C蛋白陽性表達(dá)影響因素。 結(jié)論 VEGF-C在肺癌中有較高的表達(dá)率，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示VEGF-C與肺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，可作為評估肺癌進(jìn)展客觀指標(biāo)及預(yù)測肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 肺腫瘤；免疫組織化學(xué)；血管內(nèi)皮生長因子-C

[中圖分類號] R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）32-0051-03

目前在世界范圍內(nèi)，肺癌已成為癌癥死亡的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康和生命[1]。肺癌死亡率仍高居癌癥死亡第一位，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者預(yù)后，然而腫瘤的這種生物學(xué)特性仍是研究難題。VEGF-C作為fms樣酪氨酸激酶4的配體，傾向于擴(kuò)散至淋巴系統(tǒng)，被認(rèn)為是最具特異性的淋巴管生成調(diào)控因子。本研究采用免疫組化檢測非小細(xì)胞肺癌組織及正常組織中VEGF-C表達(dá)，分析其在NSCLC中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取浙江省臺(tái)州醫(yī)院2004～2007年70例NSCLC患者住院行肺癌根治術(shù)標(biāo)本，男52例，女18例，年齡35～80歲；所有病例術(shù)前均未接受化療或放療。標(biāo)本按WHO肺癌病理組織學(xué)分型：腺癌34例，鱗癌36例；組織分化程度：低分化27例，高中分化43例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。腫瘤TNM分期：T1期18例，T2期41例，T3期9例，T4期2例。N分期：N0期33例，N1期28例，N2期9例。另取距腫塊邊緣1.5 cm的癌旁組織19例，距腫塊邊緣5 cm正常肺組織20例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與方法

兔抗人VEGF-C多克隆抗體購于美國INVITROGEN公司，Envision免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物公司。操作按試劑盒說明書進(jìn)行，采用免疫組化Envision兩步法，用高壓熱修復(fù)法，以已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 分級標(biāo)準(zhǔn)

染色強(qiáng)度及細(xì)胞陽性范圍作為分級標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞漿染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色為2分，棕褐色/胞漿內(nèi)棕黑色顆粒為3分；細(xì)胞陽性范圍計(jì)分：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞率作乘積分級：>3分為（+），6～9分為（++），9～12分為（+++），凡（+）及其以上者為陽性表達(dá)[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或四格表確切概率法，回歸分析采用Logistic回歸，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C染色結(jié)果

VEGF-C在不同肺組織中的表達(dá)見圖1。VEGF-C陽性染色為黃色、棕黃色、棕褐色，定位于細(xì)胞漿和/或膜上。VEGF-C在NSCLC中的陽性表達(dá)率為78.6%（55/70），在癌旁組織以及正常肺組織中的陽性表達(dá)率分別為31.6%（6/19）、10.0%（2/20），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 VEGF-C的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

VEGF-C在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性表達(dá)率為89.2%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C的陽性表達(dá)率為66.7%%；組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中高分化組和差分化組組間VEGF-C的陽性表達(dá)率分別為69.8%、92.6%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；VEGF-C在肺鱗癌和肺腺癌中陽性表達(dá)率分別為66.7%、91.2%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VEGF-C在腫塊直徑≤3 cm的癌標(biāo)本中陽性表達(dá)率為63.2%，在腫塊直徑>3 cm的癌標(biāo)本中陽性表達(dá)率為84.3%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；VEGF-C在男性/女性患者的陽性表達(dá)率分別為80.8%和72.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在>55歲或≤55歲的患者中，VEGF-C的陽性表達(dá)率分別為82.6%和70.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；VEGF-C在吸煙者和不吸煙者中陽性表達(dá)率分別為81.3%、72.7%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.3 VEGF-C表達(dá)與NSCLC臨床病理特征Logistic回歸分析

見表3。

將VEGF-C表達(dá)與各臨床病理特征進(jìn)行Logistic回歸分析，全變量模型分析顯示組織學(xué)分化程度入選回歸方程（B=2.487，Exp（B）=12.030），對VEGF-C蛋白表達(dá)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用向前逐步回歸模型（選入變量P ≤ 0.05，剔除變量P > 0.10）分析，組織學(xué)分化程度和腫瘤大小兩個(gè)變量入選回歸方程，對VEGF-C蛋白表達(dá)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Exp（B）分別為11.797、0.663，詳見表4。提示腫瘤的分化程度越低，腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF-C水平越高；腫瘤大小的P < 0.05，但Exp（B）值靠近1，提示腫瘤大小與VEGF-C的表達(dá)可能無關(guān)。

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見疾病，發(fā)病率和死亡率逐年上升，而非小細(xì)胞肺癌為最常見的病理類型，占肺癌的80%。肺癌患者術(shù)后常出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，成為影響患者預(yù)后主要因素[3]。腫瘤生長依賴于新生脈管的形成，腫瘤血管、淋巴管生成及侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件。淋巴轉(zhuǎn)移是肺癌較為常見轉(zhuǎn)移途徑，隨著淋巴內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制成為目前研究熱點(diǎn)。

VEGF-C作為VEGF的家族成員，研究認(rèn)為與腫瘤淋巴管生成、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，能增強(qiáng)腫瘤的淋巴管生成及侵襲能力，目前被認(rèn)為是最具特異性的淋巴管生成調(diào)控因子。VEGF-C可與其受體VEGFR-3結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并改變淋巴管生理特性。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表達(dá)與VEGFR-3的表達(dá)密切相關(guān)，促進(jìn)外周新生淋巴管的生成。研究證實(shí)VEGF-C可以選擇性地誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞存活，促進(jìn)瘤周及瘤內(nèi)形成新的淋巴管，參與淋巴管的形成以及腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。Veikkola等[5]通過轉(zhuǎn)基因小鼠研究證實(shí)VEGF-C和VEGF-D與其配體VEGFR-3結(jié)合，啟動(dòng)VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信號通路，使得皮膚淋巴管增殖，而且在功能上新生的淋巴管與正常淋巴管具有相似性。

正常人體組織中，VEGF-C主要在成人的呼吸道及消化道黏膜的內(nèi)分泌細(xì)胞中有少量表達(dá)。目前研究證實(shí)諸如口腔癌、消化道腫瘤、肺癌、腎臟腫瘤、部分肉瘤、黑色素瘤、白血病細(xì)胞及乳腺癌組織等多種具有侵襲性的腫瘤組織細(xì)胞中存在VEGF-C表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ期NSCLC中VEGF-C的陽性表達(dá)促進(jìn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移形成。在肺腺癌中VEGF-C的mRNA水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組呈現(xiàn)升高的趨勢。Ko等[6]研究報(bào)道VEGF-C在肺癌組織標(biāo)本中陽性率為76.0%，且認(rèn)為VEGF-C的陽性表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后呈正相關(guān)。Li Q等[7]報(bào)道同樣認(rèn)為肺癌中VEGF-C表達(dá)促使淋巴管新生，其表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為肺癌進(jìn)展客觀指標(biāo)及預(yù)測肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。Ishii等[8]實(shí)驗(yàn)表明高表達(dá)VEGF-C/VEGF-D的肺癌細(xì)胞株TKBS接種的裸鼠體內(nèi)局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移發(fā)生率遠(yuǎn)高于正常對照組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NSCLC和癌旁組織、正常肺組織的VEGF-C的陽性表達(dá)率分別為78.6%、31.6%、10.0%，其檢驗(yàn)差異明顯，提示VEGF-C在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要作用。根據(jù)單因素分析，VEGF-C在肺腺癌中的表達(dá)明顯高于肺鱗癌中表達(dá)，這與Ko等報(bào)道相一致。本研究中發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGF-C的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)，表明VEGF-C介導(dǎo)著腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移，在淋巴轉(zhuǎn)移途徑中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)代學(xué)利等[9]的研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C在肺腺癌病灶表達(dá)率（71.2%）明顯高于在肺鱗癌組（41.0%），腺癌病灶新生淋巴管密度（6.20±3.81）個(gè)明顯高于鱗癌組（3.95±3.18）個(gè)。結(jié)合本研究及臨床，這可能與肺腺癌極易早期出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。單因素分析發(fā)現(xiàn)VEGF-C陽性表達(dá)與患者性別、年齡、腫塊大小、吸煙情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究進(jìn)一步采用了Logistic回歸分析，分析VEGF-C的表達(dá)與各臨床病理因素的相關(guān)性。結(jié)果表明在腫瘤組織分化程度間VEGF-C差異明顯，腫瘤組織分化程度是VEGF-C蛋白陽性表達(dá)的影響因素，分化程度越低，腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF-C水平越高，說明VEGF-C與較高的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。

上述研究結(jié)果表明，VEGF-C在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示VEGF-C可作為評估肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移客觀指標(biāo)。

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（收稿日期：2012-08-22）