豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型鑒定與藥敏試驗(yàn)

蔡丙嚴(yán)等

摘要：從江蘇泰州地區(qū)疑似豬傳染性胸膜肺炎發(fā)病豬采集病料，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)得到了３株分離株ＴＺＡ１、ＴＺＡ２和ＴＺＡ３株。經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查、ＣＡＭＰ試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和血清型鑒定，確定ＴＺＡ１株和ＴＺＡ２株為血清１型，ＴＺＡ３株為血清３型。藥敏試驗(yàn)顯示，３株分離菌株對恩諾沙星、阿齊霉素、頭孢唑肟高度敏感。

關(guān)鍵詞：豬胸膜肺炎放線桿菌；血清型鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號：Ｓ８５８．２８文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）04－0780-03

胸膜肺炎放線桿菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）是革蘭氏陰性、有莢膜的多形球桿菌，有時呈線性，無鞭毛，不運(yùn)動，不形成芽孢。根據(jù)培養(yǎng)時是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ，又稱Ｖ因子），可將ＡＰＰ分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型為ＮＡＤ依賴株，包括血清型１～１２ 型和１５ 型，生物Ⅱ型的生長不依賴ＮＡＤ，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前產(chǎn)物以輔助生長，含有２個血清型，為血清型１３和１４［１］。豬感染ＡＰＰ后的疾病是豬傳染性胸膜肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｉａ，ＰＣＰ），急性暴發(fā)時有很高的發(fā)病率和死亡率。一些病豬康復(fù)后常伴有慢性肺炎，導(dǎo)致生長停滯且長期帶菌而成為其他豬的傳染源，此病給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［２］。本研究從江蘇泰州地區(qū)部分規(guī)模豬場臨床表現(xiàn)為胸膜肺炎的病料中進(jìn)行病原分離和血清型鑒定，并對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期為泰州地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎的防控、凈化提供理論支撐。

１材料和方法

１．１材料

ＰＰＬＯ瓊脂和ＮＡＤ購于揚(yáng)州市廣陵區(qū)全球通實(shí)驗(yàn)用品銷售中心；犢牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；常規(guī)培養(yǎng)基、生化試劑和藥敏紙片（氟苯尼考和強(qiáng)力霉素為自制）購于杭州天和微生物試劑有限公司；ＡＰＰ １、３、５、７、９型陽性血清購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；金黃色葡萄球菌為本實(shí)驗(yàn)室保存；待檢病料采集于泰州市規(guī)模豬場的疑似豬傳染性胸膜肺炎的病豬。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１細(xì)菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察取死亡豬的氣管分泌物和肺臟作涂片，革蘭氏染色，鏡檢；同時取病料接種于含２％ ＮＡＤ的ＰＰＬＯ瓊脂平板，在５％～１０％ ＣＯ２條件下，３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ。然后挑取可疑菌落涂片，鏡檢。純培養(yǎng)后，以４０％甘油生理鹽水或２０％脫脂牛奶于－７０ ℃保存?zhèn)溆茫郏常荨?/p>

１．２．２CＡＭＰ試驗(yàn)用金黃色葡萄球菌在兔血瓊脂平板上劃一直線，再用分離菌劃線與該線垂直但不相接觸的２條直線，３７ ℃培養(yǎng)２４～３６ ｈ，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

１．２．3生化試驗(yàn)將分離菌株分別接種含有０．０２％ ＮＡＤ的乳糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、靛基質(zhì)、甲基紅、Ｖ－Ｐ試驗(yàn)、硝酸鹽、衛(wèi)星現(xiàn)象和尿素酶等微量生化試管，３７ ℃培養(yǎng)２４～４８ ｈ，觀察和記錄試驗(yàn)結(jié)果。

１．２．4藥敏試驗(yàn)檢測分離菌株對氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、氨芐西林、頭孢唑肟和阿奇霉素８種抗生素的敏感性。將保存好的菌液（濃度稀釋到１．５×１０８個／ｍＬ） 均勻涂布在ＰＰＬＯ瓊脂上， 然后將藥敏紙片貼在平皿上，培養(yǎng)２４ ｈ后觀察結(jié)果，并按抗菌藥物藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判定分離菌株對不同抗生素的敏感程度［４］。

１．２．5菌株血清型鑒定將純化培養(yǎng)的分離菌株３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ，用生理鹽水洗下，制成生理鹽水細(xì)菌懸液。?。钡危粒校锌梢删攴謩e與ＡＰＰ １、３、５、７、９單因子標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均勻混合，按照常規(guī)方法進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，觀察結(jié)果。

２結(jié)果

２．１細(xì)菌的形態(tài)特征

病料涂片以及分離純化菌革蘭氏染色、鏡檢，都可見有革蘭氏陰性、多形態(tài)的細(xì)菌，多為球桿菌、短桿菌、偶有成絲狀的細(xì)菌，著色不均。

２．２分離菌的培養(yǎng)特性

３株分離菌在加入2% ＮＡＤ的ＰＰＬＯ固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)２４ ｈ，可見１～２ ｍｍ、露珠狀、半透明的菌落。

２．３CＡＭＰ試驗(yàn)

３株分離菌在靠近金黃色葡萄球菌的地方出現(xiàn)明顯的溶血區(qū)域，即CＡＭＰ試驗(yàn)陽性。

２．4生化試驗(yàn)

３株分離菌均呈衛(wèi)星現(xiàn)象，可水解尿素酶，發(fā)酵乳糖、果糖、葡糖糖，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖及阿拉伯糖。靛基質(zhì)、甲基紅、Ｖ－Ｐ試驗(yàn)均為陰性。硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，生長需要ＮＡＤ。

２．5血清型鑒定

ＴＺＡ１株、ＴＺＡ２株與ＡＰＰ １型陽性血清發(fā)生強(qiáng)烈的凝集發(fā)應(yīng)，鑒定為血清１型；ＴＺＡ３株與ＡＰＰ ３型陽性血清發(fā)生強(qiáng)烈的凝集發(fā)應(yīng)，鑒定為血清３型。３株菌株與生理鹽水和其他血清型的陽性血清未見凝集現(xiàn)象，結(jié)果見表１。

２．6藥敏試驗(yàn)

ＴＺＡ１和ＴＺＡ２株對恩諾沙星和阿奇霉素極度敏感。ＴＺＡ３對頭孢唑肟極度敏感。３株分離菌對氟苯尼考、丁胺卡那霉素、強(qiáng)力霉素中度敏感，對復(fù)方新諾明和氨芐西林低敏，結(jié)果見表２。

３小結(jié)與討論

３．１ＡＰＰ分離

胸膜肺炎放線桿菌營養(yǎng)要求高且受外界影響因素較多，初次比較困難。在分離的過程中，對于病死豬最好在剛死亡或頻臨死亡時采集病料，否則，即使病料中有ＡＰＰ感染，也會因豬死亡時間長，致使病料中ＡＰＰ死亡［５］。應(yīng)在初次分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入ＮＡＤ，否則APP在常規(guī)培養(yǎng)基中大多不生長或生長不良。本次分離選擇加入ＮＡＤ的ＰＰＬＯ瓊脂培養(yǎng)基，成功分離到了３株ＡＰＰ菌株。

３．２ＡＰＰ血清型鑒定

胸膜肺炎放線桿菌在不同國家和地區(qū)流行菌株的血清型有所不同［６］。研究表明，我國流行的豬傳染性胸膜放線桿菌血清型以１型、３型、７型為主［７］。因此，本試驗(yàn)選用胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)單因子陽性血清１、３、５、７、９型為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果從泰州地區(qū)規(guī)模豬場分離到的３株ＡＰＰ菌株，血清分型試驗(yàn)鑒定ＴＺＡ１和ＴＺＡ２為血清１型，ＴＺＡ３為血清３型。本次試驗(yàn)基本摸清了泰州地區(qū)ＡＰＰ流行菌株的優(yōu)勢血清型，為本地區(qū)豬場豬傳染性胸膜肺炎的免疫預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

３．3ＡＰＰ藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，３株分離菌對同種藥物的敏感性有較大差異，其中ＴＺＡ１和ＴＺＡ２兩個分離株對恩諾沙星和阿奇霉素極度敏感，而ＴＺＡ３株對頭孢唑肟極度敏感。本藥敏試驗(yàn)篩選出的恩諾沙星、阿奇霉素、頭孢唑肟和氟苯尼考可作為治療本地區(qū)PCP的首選藥物。研究表明，多種抗菌藥物對該菌的治療效果不理想［４］。獸醫(yī)臨床上常選用的氟苯尼考和強(qiáng)力霉素等藥物敏感性不高，究其原因可能是這些抗生素的大劑量、不規(guī)范使用導(dǎo)致臨床上耐藥性的產(chǎn)生。建議規(guī)?；i場在防治PCP時最好通過藥敏試驗(yàn)選用敏感度較高的抗生素，以最少的投入獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。

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