蜂膠對(duì)炭疽桿菌弱毒株的抑菌效果

孫斐,許兵紅,楊小林,張佑宏,李進(jìn)芬

摘要：為了解產(chǎn)自河南省的蜂膠對(duì)炭疽桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）弱毒株的抑菌作用，采用瓊脂平板擴(kuò)散法將實(shí)驗(yàn)分為ｐＨ ５．５～８．５不同組（蜂膠濃度３１％），以及在ｐＨ ５．５下將３１％蜂膠溶液倍比稀釋至０．０６％（１∶５１２）及空白組（０％），在每張濾紙片上滴加蜂膠溶液７ μＬ，記錄蜂膠的抑菌效果。結(jié)果表明，河南省蜂膠在ｐＨ ５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５平板上的抑菌環(huán)直徑依次為（１９．１６±０．２９）、（１７．６７±０．２９）、（１４．６７±０．５８）、（１３．６７±０．２９）、（１４．００±０．００）、（１３．３３±１．１５）、（１２．００±０．００） ｍｍ，蜂膠濃度分別為１５．５0％、７．７５％、３．８８％、１．９４％、０．９７％、０．４８％、０．２４％、０．１２％、０．０６％和０％（空白組）的抑菌環(huán)直徑依次為（１９．５０±１．８０）、（１９．６７±１．０４）、（１７．７５±０．３５）、（１５．６７±０．５８）、（１４．００±２．２９）、（１３．１７±１．０４）、（１１．８３±１．５３）、（１０．８３±１．２６）、（９．００±０．００）和（０．００±０．００） ｍｍ。說(shuō)明河南蜂膠對(duì)炭疽桿菌弱毒株有明顯的抑菌活性，對(duì)炭疽桿菌的抑菌活性隨ｐＨ值增加或濃度降低而減小。

關(guān)鍵詞：蜂膠；炭疽桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；抑菌效果

中圖分類號(hào)：Ｒ３７８．７文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）05－0926-02

The Antibacterial Activity of Propolis against an Attenuated Strain of Bacillus anthracis

ＳＵＮ Ｆｅｉ１，ＸＵ Ｂｉｎｇ－ｈｏｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｕ－ｈｏｎｇ２，ＬＩ Ｊｉｎ－ｆｅｎ１

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ， ｔｈｅ ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｐｌａｔｅｓ ｓｍｅａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ （５．５， ６．０， ６．５， ７．０， ７．５， ８．０ ａｎｄ ８．５） ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｅｓｔ， ７ μＬ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｅａｃｈ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｎｇ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ａｆｔｅｒ ２４ ｈ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ２４ ｈ， ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｐＨ ｇｒｏｕｐ， ５．５， ６．０， ６．５， ７．０， ７．５， ８．０ ａｎｄ ８．５ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ａｓ （１９．１６±０．２９），（１７．６７±０．２９），（１４．６７±０．５８），（１３．６７±０．２９），（１４．００±０．００），（１３．３３±１．１５），（１２．００±０．００） ｍｍ． Ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｅａｃｈ propolis ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ， １５．５０％，７．７５％，３．８８％，１．９４％，０．９７％，０．４８％，０．２４％，０．１２％，０．０６％ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ （１９．５０±１．８０），（１９．６７±１．０４），（１７．７５±０．３５），（１５．６７±０．５８），（１４．００±２．２９），（１３．１７±１．０４），（１１．８３±１．５３），（１０．８３±１．２６），（９．００±０．００），（０．００±０．００）ｍｍ ｏｒｄｅｒｌｙ． Ｉｔ was ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ had ｏｂｖｉｏｕｓ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐＨ ｏｒ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｒｏｐｏｌｉｓ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ

蜂膠是蜜蜂從植物芽苞或樹(shù)干上采集的樹(shù)膠混入蜜蜂上顎腺分泌物和蜂蠟后加工制成的樹(shù)脂狀固態(tài)物質(zhì)，含有大量的生物活性物質(zhì)和微量元素，具有廣泛的藥理作用。Ｋｕｊｕｍｇｉｅｖ等［１］研究報(bào)道，不同產(chǎn)地的蜂膠雖然在化學(xué)組成上有所不同，但抗菌作用基本相同，顯示蜂膠抗菌活性為混合物整體效果。Ｈｅｇａｚｉ等［２］對(duì)產(chǎn)自?shī)W地利、德國(guó)和法國(guó)三地的蜂膠對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，三地蜂膠化學(xué)組成中各成分比例不同，抗菌活性也不盡相同。近幾年，關(guān)于蜂膠研究的文獻(xiàn)日漸增多。我國(guó)對(duì)蜂膠抗菌作用的公開(kāi)報(bào)道十分零碎，尚無(wú)系統(tǒng)性研究報(bào)道，關(guān)于河南省蜂膠的抗菌活性，喬智勝等［３］曾報(bào)道從蜂膠中分離到３種對(duì)金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）具有抗菌活性的成分，以后再無(wú)相關(guān)公開(kāi)報(bào)道。我們課題組首次就河南省蜂膠對(duì)醫(yī)學(xué)原蟲的抗生作用［４］、對(duì)常見(jiàn)醫(yī)學(xué)真菌的抗菌作用［５］和對(duì)常見(jiàn)醫(yī)學(xué)細(xì)菌的抗菌作用［６］進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，現(xiàn)將河南省蜂膠對(duì)炭疽桿菌弱毒株的抑菌作用報(bào)道如下。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１蜂膠溶液配制將產(chǎn)自河南省的蜂膠溶于９５％乙醇，２周后過(guò)濾，得蜂膠乙醇溶液，計(jì)算得蜂膠濃度為３１％。

１．１．２應(yīng)試菌種炭疽桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）弱毒株購(gòu)自北京生物制品研究所，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保種，使用前接種到ｐＨ ６．５固體培養(yǎng)基上，３７ ℃恒溫培養(yǎng)１６～１８ ｈ備用。

１．２方法

１．２．１抑菌活力測(cè)定采用平板濾紙片法，濾紙片直徑６．０ ｍｍ，滅菌干燥后備用。固體培養(yǎng)基采用肉湯培養(yǎng)基，配比如下：牛肉５００ ｇ（浸液）、蛋白胨１０ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ １ ｇ、瓊脂２０ ｇ，加雙蒸水至１ ０００ ｍＬ，調(diào)ｐＨ至６．５，每個(gè)直徑７．５ ｃｍ培養(yǎng)皿加入１２ ｍＬ培養(yǎng)基，制成平板備用。細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)后，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期細(xì)菌配成６×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ菌液，?。埃?ｍＬ涂于平板上，將濾紙片加７ μＬ蜂膠溶液樣品，３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ后測(cè)量記錄抑菌環(huán)直徑。

１．２．２不同ｐＨ蜂膠抑菌實(shí)驗(yàn)設(shè)置ｐＨ ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５共８?jìng)€(gè)不同的ｐＨ值平板實(shí)驗(yàn)組，每組３次重復(fù)，記錄３１％蜂膠在不同ｐＨ值平板上的抑菌效果。

１．２．３不同濃度蜂膠抑菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基ｐＨ ５．５時(shí)，設(shè)置不同濃度蜂膠實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，蜂膠原液（３１％）倍比稀釋至１∶５１２，９５％乙醇（蜂膠濃度為０％）作對(duì)照組，即設(shè)置１個(gè)空白對(duì)照組和９個(gè)蜂膠濃度組（濃度為１５．５０％、７．７５％、３．８８％、１．９４％、０．９７％、０．４８％、０．２４％、０．１２％和０．０６％）。每組３次重復(fù)，分別記錄各組的抑菌效果。

１．２．４統(tǒng)計(jì)方法所得數(shù)據(jù)計(jì)算ｘ±ｓ，采用ｔ檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

２結(jié)果與分析

２．１不同ｐＨ下蜂膠對(duì)炭疽桿菌的抑菌效果

ｐＨ ５．０時(shí)，不適宜炭疽桿菌生長(zhǎng)，未觀察到抑菌現(xiàn)象。其余各組均有抑菌現(xiàn)象，ｐＨ ５．５時(shí)河南省蜂膠對(duì)炭疽桿菌抑菌環(huán)直徑最大，隨ｐＨ增加，抑菌環(huán)直徑變?。ū恚保?/p>

２．２不同濃度蜂膠對(duì)炭疽桿菌的抑菌效果

隨蜂膠濃度降低，對(duì)炭疽桿菌的抑菌環(huán)直徑變小，蜂膠原液稀釋至０．０６％時(shí)，仍有抑菌環(huán)，但環(huán)較小?？瞻讓?duì)照組未觀察到明顯的抑菌環(huán)（表２）。

３討論

蜂膠有著悠久的藥用歷史，其成分復(fù)雜，大約由５５％樹(shù)脂及樹(shù)香、３０％蜂蠟、１０％芳香揮發(fā)油、５％花粉及雜物組成。目前已從蜂膠中分離鑒定的成分有黃酮類、萜烯類、醌類、酯類、醛類、酚類、醚類、有機(jī)酸等，還有氨基酸、酶類、維生素類及多糖等物質(zhì)。蜂膠的化學(xué)成分取決于蜜蜂采集樹(shù)脂的植物和地區(qū)，因而不同產(chǎn)地的蜂膠化學(xué)組成不同，生物學(xué)活性也有差異。溫帶型蜂膠以歐洲蜂膠為代表，主要成分為黃酮類，如白楊素（Ｃｈｒｙｓｉｎ）、高良姜素（Ｇａｌａｎｇｉｎｅ）、松屬素（Ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、槲皮素（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、柚皮素（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、咖啡酸（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、阿魏酸（Ｆｅｒｕｌａｉｃ ａｃｉｄ）等。熱帶型蜂膠以巴西蜂膠為代表，主要成分為萜烯類、芳香酸及其酯類、脂肪酸等［７］。蜂膠中獨(dú)特的黃酮類、萜烯類物質(zhì)對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等具有抑制和殺滅作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ｐＨ ５．５時(shí)河南產(chǎn)蜂膠對(duì)炭疽桿菌弱毒株的抑菌環(huán)直徑最大，隨ｐＨ增加，抑菌環(huán)直徑變小。隨濃度降低，河南蜂膠對(duì)炭疽桿菌弱毒株的抑菌環(huán)直徑變小，蜂膠原液稀釋至１∶５１２即０．０６％時(shí)，仍有抑菌環(huán)產(chǎn)生。ｐＨ ５．５和６．０組抑菌環(huán)顯著大于其余各ｐＨ組（Ｐ＜０．０１）；ｐＨ ８．５時(shí)河南省蜂膠對(duì)炭疽桿菌抑菌環(huán)直徑最小，與ｐＨ ５．０～７．５各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）；ｐＨ ６．５～８．０各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞０．０５）。結(jié)果提示，河南蜂膠對(duì)炭疽桿菌弱毒株有明顯的抑菌活性，在酸性條件下對(duì)炭疽桿菌的抑菌活性較強(qiáng)。這種隨ｐＨ增高而抑菌活性減弱的變化規(guī)律，與課題組前期報(bào)道的河南省蜂膠對(duì)其他革蘭氏陽(yáng)性菌如溶壁微球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、甲型鏈球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、乙型鏈球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、白喉?xiàng)U菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）的抑菌結(jié)果相一致。而與對(duì)真菌白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）的抑菌作用相反。

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