四磨湯對(duì)胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞的體外增殖干預(yù)作用

王穎航，郭淑婷，牛錦銘，劉宏巖

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春,130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130117)

四磨湯又名四磨飲，《濟(jì)生方》卷二記載由人參、檳榔、沉香、天臺(tái)烏藥組成，能破滯降逆，補(bǔ)氣扶正，治七情傷感、上氣喘息、妨悶不食，諸藥合用，可奏順氣降逆，消積止痛之功。文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]顯示，四磨湯作為促胃腸動(dòng)力中藥得到廣泛使用，臨床上的應(yīng)用已涉及到內(nèi)、外、婦、兒等各科，且取得了較好的療效。四磨湯對(duì)于胃腸動(dòng)力障礙性疾病有明顯調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的作用。有研究[3-4]證實(shí)ICC是胃腸道的起搏細(xì)胞,可產(chǎn)生自發(fā)電節(jié)律變化，沿胃腸道傳遞形成慢波。并且還具有傳導(dǎo)慢波，介導(dǎo)腸神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等重要功能。胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)生與ICC密切相關(guān)，特別是腸道ICC細(xì)胞數(shù)量的減少或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的破壞[5-7]。Gibbons等[8]證實(shí)在人類正常結(jié)腸道組織內(nèi),ICC的凋亡是一個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，ICC凋亡的程度反映了ICC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的更新能力。因此,延緩ICC的凋亡,維持完整的ICC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)對(duì)于預(yù)防和治療胃腸道動(dòng)力障礙性疾病有重要意義。本實(shí)驗(yàn)初步探討了四磨湯對(duì)ICC體外增殖的干預(yù)作用,為四磨湯對(duì)胃腸動(dòng)力障礙性疾病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠，昆明種小鼠(出生后15 d),雌雄不拘。由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 M199培養(yǎng)基(Gibco),SCF(Sigma)，Ⅱ型膠原酶(Gibco)，胎牛血清，MTT(Sigma)，DMSO(Sigma)，F(xiàn)icoll400(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 小腸組織單細(xì)胞懸液的制備 小鼠禁食12 h后，無(wú)菌條件下取距離回盲部10 cm的小腸，放入培養(yǎng)皿，剝離系膜與血管，用PBS(pH 7.0)將小腸內(nèi)容物沖洗干凈，將小腸用注射器針頭縱行剖開(kāi)，剝離黏膜層，PBS反復(fù)沖洗肌條3～4次，將肌條剪碎至1～2 mm3小塊后放入燒杯中，加入 Ⅱ 型膠原酶(1.3 mg/mL)，37 ℃消化30 min。然后過(guò)200目篩網(wǎng)濾去大塊組織，離心，1 500 r/min，3 min。去上清，用10 mL M199重懸細(xì)胞，將細(xì)胞加入等體積Ficoll400梯度密度液上，3 000 r/min離心10 min，取液面交界細(xì)胞沉淀。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用M199培養(yǎng)基(含M199，10%FBS，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL、5 ng/mLSCF)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL,接種至6孔培養(yǎng)板，板中預(yù)先放置包被鼠尾膠原(2 ng/cm2)的蓋玻片。放入培養(yǎng)箱內(nèi)，在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后換液，移除未貼壁細(xì)胞，加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 藥物干預(yù)

1.2.3.1 直接給藥途徑 四磨湯按照中藥常規(guī)煎煮方法，收集藥液，反復(fù)離心除雜質(zhì)取上清，于50 ℃濃縮至1 g/mL藥液，倍比稀釋成低劑量組(1 μg/50 μL)，中劑量組(2 μg/50 μL)，高劑量組(4 μg/50 μL)3組；過(guò)濾除菌,于-20 ℃冰箱保存。MTT法測(cè)定：調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，每孔200 μL接種于96孔板,用含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步。

實(shí)驗(yàn)共分4組，即空白對(duì)照組；四磨湯低、中、高劑量組；每個(gè)劑量設(shè)6孔，加滅菌后的四磨湯藥液干預(yù)，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，再繼續(xù)孵育4 h后去上清，每孔加入DMSO100 μL，振蕩混勻10 min，于酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.3.2 含藥血清給藥途徑 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、四磨湯低劑量組、中劑量組、高劑量組。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，四磨湯給藥組以臨床成人日用量的10倍作為中劑量，20倍和5倍分別作為高劑量和低劑量。灌胃給藥連續(xù)7 d，第7天重復(fù)給藥2次,間隔時(shí)間2 h，并于末次給藥1 h后眼球取血，無(wú)菌條件下分離血清，置56 ℃水浴30 min滅活，再經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌，加入M199培養(yǎng)基，使之終濃度分別為：10%，20%，30%。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，每孔200 μL接種于96孔板,用含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右,加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步。

實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組，四磨湯含藥血清低、中、高劑量組；每個(gè)劑量設(shè)6孔,加含藥血清干預(yù)，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h各孔加入MTT(5 g/L)20 μL，再繼續(xù)孵育4 h后去上清，每孔加入DMSO100 μL，振蕩混勻10 min，于酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

2 結(jié)果

2.1 直接給藥途徑四磨湯對(duì)ICC的體外增殖干預(yù)作用 見(jiàn)表1。

表1 直接給藥途徑四磨湯對(duì)ICC的增殖作用(±s)

表1結(jié)果顯示：四磨湯中、高劑量組不同程度地促進(jìn)了Cajal間質(zhì)細(xì)胞的增殖，其中以中劑量組促進(jìn)作用最為明顯，二者與空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 含藥血清給藥途徑四磨湯對(duì)ICC的體外增殖干預(yù)作用 見(jiàn)表2。

表2 含藥血清給藥途徑四磨湯對(duì)ICC的增殖作用(±s)

表2結(jié)果顯示：四磨湯含藥血清組干預(yù)ICC 48 h后,其細(xì)胞增殖率與空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中，10%、20%濃度的含藥血清的細(xì)胞增殖率顯著升高，而30%濃度的含藥血清細(xì)胞增殖率下降，提示不同濃度的四磨湯含藥血清對(duì)ICC增殖作用強(qiáng)度不同;10%、20%含藥血清組具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，30%含藥血清組具有抑制ICC增殖的趨勢(shì)。

3 討論

ICC是胃腸道內(nèi)一種與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)的特殊類型的間質(zhì)細(xì)胞,是具有獨(dú)立功能的特殊間質(zhì)細(xì)胞,以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在于胃腸道[9]。作為胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)的一種非神經(jīng)但又與神經(jīng)密切相關(guān)的特殊間質(zhì)細(xì)胞,有潛在的控制胃腸道動(dòng)力的作用。ICC減少在頑固性慢傳輸性便秘患者結(jié)腸動(dòng)力障礙的發(fā)生機(jī)制中有非常關(guān)鍵的作用[10]。四磨湯在臨床上被廣泛應(yīng)用于胃腸動(dòng)力障礙性疾病，具有很好的臨床基礎(chǔ)[11]，現(xiàn)代藥理[12-14]實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了其明確的促胃腸動(dòng)力的作用。但目前仍不清楚究竟四磨湯通過(guò)何種途徑防治胃腸功能障礙性疾病。因此，對(duì)四磨湯促胃腸動(dòng)力的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究極其必要。本研究通過(guò)直接給藥與含藥血清給藥2種途徑,采用MTT法對(duì)ICC的增殖進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示:四磨湯在一定的給藥途徑和藥物濃度情況下具有促進(jìn)ICC增殖作用，我們分析，四磨湯在臨床上被廣泛應(yīng)用于胃腸動(dòng)力障礙性疾病的基礎(chǔ)有可能是通過(guò)促進(jìn)ICC增殖而發(fā)揮的作用,其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]李玉潔,劉柏炎,易健,等.四磨湯治療非胃腸術(shù)后胃腸功能障礙的Meta分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(1):255-260.

[2]蔡光先,卜獻(xiàn)春.四磨湯治療功能性消化不良肝脾不和證的療效及對(duì)血漿P物質(zhì)、胃動(dòng)素的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(6):856-859.

[3]Hanani M,Freund HR.interstitial cells of Cajal-their role in pacing and signal transmission in the digestive system[J].Acta Physiol Scand,2000,174:237-246.

[4]Sanders KM,Tamas O,Koh SD,et al.A novel pacemarker mechanism drives gastrointestinal rhymicity[J].News Physiol Sci,2000,15:291-298.

[5]Iino S,Horiguchi K.Interstitial cells of Cajal are involved in neurotransmission in the gastrointestinal tract[J].Acta Histochem Cytochem,2006,39(6):145-153.

[6]Wedel T,Bottner M,Krammer HJ.The enteric nervous system and interstitial cells of Cajal:Changes in chronic constipation in adults[J].Pathologe,2007,28(2):143-148.

[7]孫改俠,黃秀深,羅明鳳,等.理中丸含藥血清對(duì)中焦?jié)褡枳CCajal間質(zhì)細(xì)胞代謝作用的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(4):350-352.

[8]Gibbons SJ,De Giorgio R,Pellegrini MS,et al.Apoptotic cell death of human interstitial cells of Cajal[J].Neurogastroenterol Motil,2009,21(1):85-93.

[9]Sanders KM,Ordog T,Koh SD,et al.Development and plasticity of interstitial cells of Cajal[J].Neurogastroenterol Motil,1999,11(5):311-338.

[10]楊關(guān)根,劉智勇,楊琴燕,等.便秘二號(hào)方對(duì)慢傳輸型便秘大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及C-KIT表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2010,16(2):203-206.

[11]姚紅艷.四磨湯治療功能性消化不良40例[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2011,20(7):1152.

[12]鄭毅,韋青,李杰森.四磨湯治療功能性消化不良98例療效觀察[J].河北中醫(yī),2005,27(11):815.

[13]戴遲兵,劉娜,陳文妹,等.四磨湯對(duì)大鼠胃竇平滑肌影響及其機(jī)制的研究[J].胃腸病學(xué),2011,16(10):605-608.

[14]韓棉梅,梁嘉愷,陶雙友,等.四磨湯口服液對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙模型大鼠胃殘留、小腸推進(jìn)率及結(jié)腸P物質(zhì)的影響[J].新中醫(yī),2011,43(12):114-115.