薄膜分散聯(lián)合凍融法制備小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體研究

邱瑞桂 靳世英 徐和 徐平華 靳士曉 孟小林 袁海龍 韓晉

小菜蛾抗菌肽(pxCECA1 from Plutella xylostella，CA)屬于動物抗菌肽，是從昆蟲小菜蛾幼蟲體內(nèi)提取分離而得，具有抗菌活性高，抗菌譜廣的特點(diǎn)［1］。而且由于抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞其完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出胞外而死亡。這一獨(dú)特的抗菌靶位點(diǎn)和新的抗菌機(jī)制，使得細(xì)菌難以對抗菌肽產(chǎn)生抗藥性，從而能有效抑制和殺死耐藥性病原菌［2］。但CA 易降解變質(zhì)，經(jīng)純化的CA 在室溫下放置5 天將會發(fā)生降解，而且隨溫度的增高，降解速率越快，注射給藥后，體內(nèi)分解破壞快［1］。

脂質(zhì)體(liposomes)是由一種或多種兩親性分子雙層膜包裹而成的具有一個或多個水性腔室的微泡，將藥物包裹或鑲嵌在脂質(zhì)體中形成脂質(zhì)體藥品。脂質(zhì)體作為活性物質(zhì)的載體，具有緩釋和促進(jìn)透皮吸收作用的功能，若將CA 制成脂質(zhì)體，有望提高藥物的穩(wěn)定性及利用率［3］。脂質(zhì)體的制備方法很多，有薄膜法、復(fù)乳法、逆相蒸發(fā)法、乙醚注入法、反復(fù)凍融法等［4］，由于CA 的熱不穩(wěn)定性，筆者采用薄膜超聲聯(lián)合反復(fù)凍融法制備CA 脂質(zhì)體，最后將其冷凍干燥成粉末，并對其形態(tài)、粒徑及分布、包封率、加速穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，為CA 脂質(zhì)體劑型提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent ll00 高效液相色譜儀(含在線脫氣機(jī);四元梯度泵;自動進(jìn)樣器;DAD 檢測器;HP Chem．station 化學(xué)作站，Agilent 公司);掃描電鏡(S-4800，日立，日本);NanoZS90 粒徑分析儀(Malvern 公司);渦旋混合器(WH861，北京科爾德科貿(mào)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海醫(yī)械專機(jī)廠);冷凍干燥機(jī)(美國Labconco 公司)。

CA 原料藥(98．6%，批號:20120421，由解放軍302 醫(yī)院藥學(xué)部制劑研究室自制)、CA 對照品(99.8%，批號:20120405，由武漢大學(xué)提供);卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司);膽固醇(天津市博迪化工有限公司);甘露醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2．1 CA 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備。按優(yōu)化處方，稱取卵磷脂、膽固醇，置圓底燒瓶中，加入氯仿20 ml 溶解，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸除有機(jī)溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。將300 μg CA 溶入含有5%甘露醇的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6．5)，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時間后，冰水浴探頭超聲15 分鐘，即得CA 脂質(zhì)體混懸液?；鞈乙悍湃耄?0 ℃冰箱冷凍24 小時一定時間，然后在室溫下解凍，反復(fù)凍融，經(jīng)冷凍干燥后即得CA 脂質(zhì)體凍干粉。

2．2 正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體處方

經(jīng)單因素試驗(yàn)預(yù)試，確定對包封率影響較大的因素為卵磷脂與膽固醇比值(A)，卵磷脂與CA 比值(B)，水化體積(C)，凍融次數(shù)(D)，各因素設(shè)3 個水平(如表1)。以藥物包封率為主要評價指標(biāo)，脂質(zhì)體粒徑及分布為輔助，按L9(34)正交設(shè)計表安排正交試驗(yàn)，確定CA 脂質(zhì)體的最優(yōu)處方及工藝。

表1 正交設(shè)計因素水平表

由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，各因素對藥物包封率影響大小的順序?yàn)锽 ＞A ＞D ＞C。得到各因素的最佳組合為A3B2C2D3，即卵磷脂與膽固醇比值為4∶ 1，卵磷脂與CA 比值為20∶ 1，水化體積為10 mL，凍融3 次。隨著凍融次數(shù)的增加，藥物的包封率得到了增加，但脂質(zhì)體的粒徑分布也隨之增大，從而增大了CA 脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性。綜合考慮對包封率與粒徑的影響，最終確定以凍融2 次為佳。

2．3 CA 脂質(zhì)體掃描電鏡形態(tài)觀察

將脂質(zhì)體粉末均勻涂在掃描電鏡樣品池上，表層噴金以獲得更好的導(dǎo)電率，將樣品池置于掃描電鏡內(nèi)觀察，掃描電壓設(shè)為1．5 KV?？梢奀A 脂質(zhì)體粒子均勻、圓整，為球形或類球形，見圖1。

2．4 CA 脂質(zhì)體粒徑及分布測定

CA 脂質(zhì)體復(fù)溶后用水稀釋，經(jīng)激光散射粒度分析儀測定脂質(zhì)體粒徑及分布。結(jié)果表明，CA 脂質(zhì)體粒度分布較均勻，平均粒徑為(223．1±31．2)nm，多分散性指數(shù)為0．189。粒徑分布圖見圖2。

圖1 CA 脂質(zhì)體掃描電鏡圖

圖2 CA 脂質(zhì)體粒徑分布圖

2．5 CA 脂質(zhì)體包封率的測定

2．5．1 HPLC 測定CA 含量方法的建立

HPLC 色譜條件:色譜柱為Agilent Alltima C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)，流動相為0．05%三氟乙酸(TFA)溶液－甲醇－乙腈(95∶ 2．5∶ 2．5)，用前經(jīng)0．45 μm 濾膜濾過，流速1．0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，檢測波長275 nm，柱溫25 ℃。

對照品溶液的制備:精密稱取CA 對照品5．0 mg，置50 ml 量瓶中，加純凈水溶解并稀釋至刻度，得100 μg/ml CA 對照品儲備液。

線性關(guān)系考察:精密吸取對照品溶液適量，用流動 相 分 別 配 制 成1．25、2．5、5、12．5、25 和50 μg/ml系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件，分別精密吸取10 μl 進(jìn)樣，以峰面積對進(jìn)樣量(μg)作線性回歸。得線性回歸方程為(n=6):Y=4．046×104X+1．034×103，r=0．9994。結(jié)果表明，抗菌肽濃度在1.25 ～50 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度與回收率:分別取低、中、高三個濃度(2．5、12．5、37．5 μg/ml)的CA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測定6 次，連續(xù)6 天測定，計算得出日內(nèi)、日間RSD 分別為1．87%、1．65%、1．53%和2．51%、1．97%、1.59%。平均回收率為99．7%、100．4%、100．7%，RSD 為1．68%。

2．5．2 包封率的測定

凍干前:精密量取CA 脂質(zhì)體混懸液200 μl 置10 ml 量瓶中，加入1 ml 乙醇，超聲20 分鐘，放冷至室溫，用流動相定容，進(jìn)樣測定總藥物量。另取脂質(zhì)體混懸液適量置1．5 ml 離心管中，8000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，精密量取上清液200 μl 置10 ml 量瓶中，同上操作，測定游離藥物量，計算包封率。

凍干后:精密稱取CA 脂質(zhì)體凍干粉5 mg 置5 ml量瓶中，加蒸餾水復(fù)溶，搖勻，得脂質(zhì)體混懸液。精密量取脂質(zhì)體混懸液200 μl 置10 ml 量瓶中，加乙醇1 ml，超聲20 分鐘，放冷至室溫，用流動相定容，進(jìn)樣測定總藥物量。另取脂質(zhì)體混懸液適量置1．5 ml 離心管中，8000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，精密量取上清液200 μl 置10 ml 量瓶中，同上操作，測定游離藥物量，計算包封率。結(jié)果，CA 脂質(zhì)體在冷凍干燥前的平均包封率為59%，在經(jīng)過冷凍干燥處理后，其包封率得到了提高。同時，粒徑和多分散指數(shù)也相應(yīng)增大。見表2。

表2 CA 脂質(zhì)體凍干前后的指標(biāo)變化

2．6 CA 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

分別在4 ℃和25 ℃下，將凍干后的CA 脂質(zhì)體樣品放置3 個月，于0、1、2、3 月取樣，考察脂質(zhì)體的外觀、再分散性、含量、滲漏率、粒徑及多分散指數(shù)。考察結(jié)果顯示，4 ℃下保存的脂質(zhì)體凍干品為類白色塊狀物，隨時間無明顯變化，而25 ℃下保存的樣品隨時間的推移逐漸變?yōu)榈S色塊狀物。各時間點(diǎn)取樣加水振搖進(jìn)行再分散，25 ℃下貯存的CA 脂質(zhì)體的再分散性明顯比4 ℃條件下的樣品要慢，且伴有膠狀物長時間不能分散。4 ℃條件下的各時間點(diǎn)CA 脂質(zhì)體樣品均能在2 分鐘內(nèi)快速分散成均勻的混懸液，再分散性良好。25 ℃條件下，CA 脂質(zhì)體滲透率、粒徑及多分散性均顯著高于4 ℃下樣品的相應(yīng)指標(biāo)，穩(wěn)定性顯著降低。見表3。(滲漏率=儲存一定時間后滲漏到介質(zhì)中的藥量/儲存前包封的藥量×100%)

表3 CA 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察指標(biāo)變化表

3 討論

親水性藥物脂質(zhì)體無論是在制備還是儲存過程中都存在一個滲漏的問題，藥物分配在外水相增多，使包封率降低。反復(fù)凍融法被證明是一種有效的保護(hù)藥物不滲漏的方法［4-5］。與其他方法相比，凍融法具有操作簡單、包封率高、藥物避免接觸有機(jī)溶媒等特點(diǎn)，且制備過程無需加熱，尤其適用于對熱不穩(wěn)定的水溶性藥物。本研究采用薄膜分散聯(lián)合凍融法制備了CA 脂質(zhì)體，并對其形態(tài)、粒徑、zeta 電位、包封率及貯存穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。

試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選制備的CA 脂質(zhì)體粒子均勻、圓整，為球形或類球形，平均粒徑為(223．1±31．2)nm，多分散性指數(shù)為0．189，zeta 電位為－35．8 mV。多分散指數(shù)與zeta 電位是評價膠體分散體系物理穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，上述試驗(yàn)結(jié)果預(yù)示了CA 脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。

為了降低CA 脂質(zhì)體在冷凍、融化和水合過程中的破壞，作者在處方中加入了甘露醇作為冷凍防護(hù)劑。采用薄膜分散聯(lián)合凍融法制備的CA 脂質(zhì)體包封率為62%，相比未經(jīng)過凍融處理的樣品包封率提高了12%。凍融法提高包封率的機(jī)理可能是由于冰凍使磷脂周圍藥物濃度增高，在反復(fù)凍融過程中粒徑小的脂質(zhì)體互相融合成稍大脂質(zhì)體，粒徑趨于均勻化，使脂質(zhì)體包封率明顯提高［6］;也有學(xué)者認(rèn)為凍融法提高包封率的機(jī)理可能是形成了某種暫時的孔洞使藥物在平衡前由外相進(jìn)入了內(nèi)水相中［7］。在凍融過程中，本課題組以包封率為指標(biāo)對凍融次數(shù)進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨凍融次數(shù)的增加，CA 包封率逐漸增加，但同時脂質(zhì)體粒徑分布也隨之明顯增大，增加了藥物制劑貯存的不穩(wěn)定性，所以在保證包封率較高的前提下，本課題組選擇了凍融2 次為最佳工藝，脂質(zhì)體平均粒徑控制在223 nm左右。

最后本課題組采用冷凍干燥法將CA 脂質(zhì)體制成干粉以降低磷脂及藥物的氧化和水解速度，同時，凍干保護(hù)劑也保持了脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的完整性，克服脂質(zhì)體聚集、融合及藥物滲漏等不穩(wěn)定因素［8-9］，解決了CA 脂質(zhì)體長期貯存穩(wěn)定性問題。

［1］ Hong Wang，Xiao-lin Meng，Jin-ping Xu，et al．Production，purification，and characterization of the cecropinfrom Plutella xylostella，pxCECA1，using an intein-induced self-cleavable system in Escherichia coli［J］． Appl Microbiol Biotechnol，2012，94(4):1031-1039．

［2］ Casteels P，Ampe C，Jacobs F，et al．Apidaecins:antibacterial peptides from honeybees［J］．The EMBO Journal，1989，8(8):2387-2391．

［3］ 朱雨晴，石森林．中藥脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究進(jìn)展［J］． 藥學(xué)學(xué)報，2009，44(11):1211-1215．

［4］ 劉曉謙，王錦玉，仝燕，等． 脂質(zhì)體制備技術(shù)及其研究進(jìn)展［J］． 中國藥學(xué)雜志，2011，46(14):1084-1088．

［5］ 董澤民．賴氨匹林脂質(zhì)體鼻腔給藥的研究［J］．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1995，26(5):199-202．

［6］ 張奇，鄧英杰．凍融法制備5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體及其穩(wěn)定性考察［J］． 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2000，17(2):87-89．

［7］ 米宏杰，王瑞華，徐冰． 簡述親水性藥物脂質(zhì)體的制備［J］． 中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2006，12(16):2219-2220．

［8］ 王健，李明軒． 冷凍干燥對提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究概況［J］． 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(9):576-580．

［9］ 鄧禮荷，韋敏燕，湯晨懿，等．凍干工藝及保護(hù)劑對羥基喜樹堿脂質(zhì)體質(zhì)量的影響［J］． 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43(1):30-34．