郫縣豆瓣高酶活米曲霉選育鑒定及復(fù)合菌制曲改善酶系組成研究——郫縣豆瓣復(fù)合菌制曲改善酶系組成研究

李 峰，趙 萍，周昌豹，謝 彪

（四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130）

郫縣豆瓣是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，經(jīng)自然接種發(fā)酵，日曬夜露形成的獨(dú)具風(fēng)味的傳統(tǒng)特色調(diào)味品。郫縣豆瓣采用的是傳統(tǒng)開放式發(fā)酵工藝，生產(chǎn)當(dāng)中的微生物都是自然接種，郫縣豆瓣發(fā)酵醅當(dāng)中的微生物種類和數(shù)量受季節(jié)和氣候的影響，導(dǎo)致郫縣豆瓣品質(zhì)不穩(wěn)定，發(fā)酵周期長，這也制約了行業(yè)快速發(fā)展。因此如何縮短郫縣豆瓣發(fā)酵周期，提高產(chǎn)品品質(zhì)，是研究的必然趨勢。

影響郫縣豆瓣生產(chǎn)周期的生產(chǎn)環(huán)節(jié)是蠶豆瓣的制曲發(fā)酵和豆瓣醬的曬露。蠶豆發(fā)酵主要是利用豆瓣曲中的米曲霉產(chǎn)生的各種酶類進(jìn)行酶解原料，產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮和糖類物質(zhì)及有機(jī)酸，傳統(tǒng)發(fā)酵時間是2～3個月，曬露工藝主要是酵醅中的酵母和細(xì)菌將蠶豆醬中的氨基酸態(tài)氮、糖類物質(zhì)及有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為郫縣豆瓣的風(fēng)味物質(zhì)的過程，可見蠶豆發(fā)酵是控制發(fā)酵周期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此如何提高蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮及糖類將有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成，并縮短發(fā)酵時間。

目前很多生產(chǎn)企業(yè)已采用純種米曲霉生產(chǎn)制曲，如果縮短發(fā)酵時間會導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮低、風(fēng)味淡薄等問題，其原因是市售曲精中的米曲霉主要是中性蛋白酶為主，酸性蛋白酶和淀粉酶活力低。本實(shí)驗(yàn)將使用從郫縣豆瓣生產(chǎn)過程中篩選出的高酶活米曲霉進(jìn)行復(fù)合菌制曲，提高豆瓣曲總酶活，改善豆瓣曲的酶系組成，有效提高豆瓣產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮和還原糖含量，縮短發(fā)酵時間提高產(chǎn)品品質(zhì)，解決行業(yè)的共性問題。

1 郫縣豆瓣生產(chǎn)工藝流程

郫縣豆瓣生產(chǎn)工藝流程圖。

脫殼的蠶豆瓣除雜、浸泡后與曲精和面粉拌勻，進(jìn)入制曲池制曲，成曲拌入鹽水在發(fā)酵池發(fā)酵。

鮮辣椒采收后經(jīng)除雜、清洗、斬拌后加入食鹽，入鹽漬池貯存，然后與發(fā)酵成熟的豆瓣醬混合，經(jīng)曬露后，進(jìn)行加工包裝。

2 材料和試劑

主要原料：蠶豆、面粉、麩皮和豆粕。

實(shí)驗(yàn)菌株：菌種ddQ-125和jcQ-93，分離自郫縣豆瓣生產(chǎn)企業(yè)，本實(shí)驗(yàn)室保存，將ddQ-125菌株標(biāo)記為A，jcQ-93菌株標(biāo)記為B；市售商品曲精為C，后面將以標(biāo)記菌株A、B、C進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

固體培養(yǎng)基：按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的拌勻。121℃、0.1MPa滅菌45min。

主要試劑：福林試劑（Folin試劑）、二硝基水楊酸（DNS）試劑均為實(shí)驗(yàn)室自配；其他試劑均購自成都百旺化學(xué)試劑公司。

主要儀器：752型紫外可見分光光度計(jì)，HH-600（0）型電子恒溫水浴鍋，LXJ-II離心沉淀機(jī)，PHS-3C型精密pH計(jì)，LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，XS-18型光學(xué)顯微鏡。

3 檢測方法

3.1 酶活力測定

粗酶液制取方法：上述制得固體曲樣品中按重量加入1:20（w/v）的緩沖溶液，于40℃水浴中浸提1h，間歇攪拌，過濾得粗酶液。此粗酶液用于下述各種酶活性測定。

3.1.1 蛋白酶測定方法

采用福林酚法。

3.1.2 淀粉酶測定

樣品處理：酶液提取方法同蛋白酶測定，取5mL粗酶液，7000r/min離心30min，吸取上清液測定酶活性。

酶活測定方法：參照Michael Somogyi的方法進(jìn)行測定。

3.1.3 氨基酸態(tài)氮的測定

樣品處理：稱取約20.0g已剁細(xì)的試樣置于200mL燒杯中，加入100mL水，加熱煮沸，冷卻移入200mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯，洗液并入容量瓶，并加水至刻度，混勻，將樣液過濾，濾液備用。

測定方法：采用甲醛滴定法測定樣品中郫縣豆瓣的氨態(tài)氮。

3.1.4 還原糖的測定

按照Miller的方法，采用DNS（二硝基水楊酸）比色法法測定郫縣豆瓣樣品中的還原糖。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 種曲培養(yǎng)

按照麩皮:豆粕為4:1的比例混勻，并加入干料量75%（v/w）的水，拌勻。121℃、0.1 MPa滅菌45min，冷卻后分別接入菌種A、B、C，30℃恒溫培養(yǎng)72h。

4.2 單菌種制曲

將蠶豆在95℃熱水中漂燙10min 后，浸泡程度為豆肉無白心，瀝干涼冷至40℃，按照蠶豆:面粉為4:1的比例混合，再接入3%種曲充分混合，攤?cè)肭P中品溫控制在33℃～37℃，相對濕度90%，曲料結(jié)快翻曲，發(fā)酵時間72h出曲。成曲有茂盛的黃綠色孢子。

4.3 混合菌種制曲

同方法4.2，接入的菌種為A、B混合種曲。分別按A:B為2:1進(jìn)行制曲，測定酶活。

4.4 保溫發(fā)酵

曲瓣子與鹽水按傳統(tǒng)工藝要求的比例混合后入池進(jìn)行保溫發(fā)酵，水浴溫度在50℃～55℃，品溫在40℃～45℃，發(fā)酵周期為25d～35d成熟，制成成熟瓣子（甜瓣子）。測氨基酸態(tài)氮和還原糖。

5 結(jié)果與分析

蛋白酶的作用是將原料蠶豆及面粉中含的蛋白質(zhì)，經(jīng)蛋白酶分解作用，逐步降解成胨、多肽和氨基酸。有些氨基酸是呈味的，就變成豆瓣醬的風(fēng)味成分。淀粉酶作用可使原料中的淀粉糖化產(chǎn)生葡萄糖，為曲霉、酵母菌及其他微生物提供了碳素營養(yǎng)，同時在豆瓣發(fā)酵階段，淀粉酶繼續(xù)將淀粉糖化，成為豆瓣的甜味成分。同時，一部分糖類作為酵母菌和乳酸菌的發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和有機(jī)酸，是構(gòu)成成品風(fēng)味的重要成分。所以，蛋白酶、淀粉酶的協(xié)同作用對豆瓣的色、香、味均有重大影響。

5.1 單菌株酶系組成

圖1 單菌株的酶系組成Fig.1 Enzymes of the single strain

米曲霉所產(chǎn)蛋白酶，根據(jù)作用的最適pH值可以分為3類：酸性蛋白酶（最適pH值為3）、中性蛋白酶（最適pH值為7）、堿性蛋白酶（最適pH值為9～10）。一般郫縣豆瓣生產(chǎn)用米曲霉蛋白酶中，中性蛋白酶活性較強(qiáng)，酸性蛋白酶活性較弱。由圖1可知，菌株A酸性蛋白酶活力最強(qiáng)，菌株B的中性蛋白酶和淀粉酶的酶活力較菌株最強(qiáng)。

5.2 單菌株與復(fù)合菌種制曲過程中酶活變化

本實(shí)驗(yàn)考察了菌種A、B、C及AB菌種混合制曲過程中酸性、中性蛋白酶活力及淀粉酶的變化。

圖2 制曲過程中性蛋白酶活性變化Fig.2 Changes of neutral protease activity during Qu making process

單菌株制曲的蛋白酶活力在60h時出現(xiàn)最高值，對照組產(chǎn)酶高峰在66h～70h，篩選出的菌株單菌株制曲的酶活力較高，菌株A酸性蛋白酶最高達(dá)1650U/g，菌株B中性蛋白酶活力最高達(dá)3200U/g，淀粉酶活力最高達(dá)300U/g，其中菌株B的總酶活為4300U/g，復(fù)合菌制曲其總酶活力高達(dá)4550U/g，且3種酶的活力均衡，能滿足郫縣豆瓣多種酶協(xié)調(diào)作用。

圖3 制曲過程酸性蛋白酶活性變化Fig.3 Changes of acidic protease activity during Qu making process

圖4 制曲過程淀粉酶活性變化Fig.4 Changes of amylase activity during Qu making process

5.3 酶活與發(fā)酵郫縣豆瓣氨基酸態(tài)氮、還原糖的關(guān)系

為研究實(shí)驗(yàn)菌株各酶活性與發(fā)酵郫縣豆瓣指標(biāo)氨態(tài)氮和還原糖的影響關(guān)系，采用保溫發(fā)酵工藝制備單菌株、復(fù)合菌株發(fā)酵郫縣豆瓣實(shí)驗(yàn)，在前期對單菌株制曲酶活性變化研究基上，采用制曲時間為60h，豆瓣保溫發(fā)酵時間25d。制曲酶活及發(fā)酵樣品中氨基酸態(tài)氮和還原糖含量見附表。

附表 制曲酶活及發(fā)酵樣品中氨基酸態(tài)氮和還原糖含量Attached table Enzyme activity of Qu and content of ammonia nitrogen and reducing sugar in fermentation samples

從附表可以看出，篩選出的高酶活菌株其豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮和還原糖含量均高于市售曲精，而混合菌株又明顯高于單菌株且氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到1.2mg/100g、還原糖含量達(dá)到5.4%，且產(chǎn)品醬香濃郁，色澤紅亮。

6 結(jié)論

混合制曲的目的即在中性蛋白酶活力保持在要求的基礎(chǔ)上，旨在提高成曲中酸性蛋白酶和淀粉酶的活力，為后期發(fā)酵提供更充足、更高活力的酶系。

將菌株ddQ-125、jcQ-93和市售曲精單獨(dú)制曲以及菌株ddQ-125和jcQ-93混合接種發(fā)酵制曲的豆瓣曲進(jìn)行保溫發(fā)酵25d，對豆瓣曲酶活及豆瓣醬氨基酸態(tài)氮和還原糖含量分析，其中菌株單獨(dú)制曲及混合制曲發(fā)酵的豆瓣醬其氨基酸態(tài)氮含量均高于市售曲精，且混合菌制曲的指標(biāo)高于單獨(dú)制曲，其中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到1.2mg/100g、還原糖含量達(dá)到5.4%；菌株A酸性蛋白酶最高達(dá)1650U/g，菌株B中性蛋白酶活力最高達(dá)3200U/g，淀粉酶活力最高達(dá)300U/g，其中菌株B的總酶活為4300U/g，復(fù)合菌制曲其總酶活力高達(dá)4550U/g，且3種酶的活力均衡，可見復(fù)合菌制曲提高了豆瓣曲綜合酶活力，克服了單菌種制曲酶系不均衡的問題，能為豆瓣發(fā)酵提供充足的酶系，有效提高氨基酸態(tài)氮和還原糖含量，為縮短發(fā)酵時間奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，為郫縣豆瓣規(guī)范化生產(chǎn)和規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)保障。

通過實(shí)驗(yàn)，郫縣豆瓣產(chǎn)品在保持傳統(tǒng)郫縣豆瓣特色的前提下，縮短生產(chǎn)周期1/3（傳統(tǒng)工藝發(fā)酵期為50d～60d），氨基氮含量達(dá)0.8g/100g～1.2g/100g，豆瓣醬的醬酯香味明顯增加。對篩選出的菌株培養(yǎng)的豆瓣曲及發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測，其黃曲霉毒素B1小于2ppb，低于國家標(biāo)準(zhǔn)5ppb，可以進(jìn)一步進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。

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