量子點(diǎn)分子信標(biāo)的制備及其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

賈滬寧，葉寶芬，嚴(yán)拯宇

（中國(guó)藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

進(jìn)展與述評(píng)

量子點(diǎn)分子信標(biāo)的制備及其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

賈滬寧，葉寶芬，嚴(yán)拯宇

（中國(guó)藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

量子點(diǎn)具有耐光漂白、顏色可調(diào)、一元激發(fā)/多元發(fā)射以及發(fā)射光譜窄等特性，故將其應(yīng)用在分子信標(biāo)中，必將克服傳統(tǒng)有機(jī)染料的很多缺點(diǎn)。量子點(diǎn)分子信標(biāo)不但靈敏度高、光穩(wěn)定性好，而且可以進(jìn)行多重檢測(cè)。本文就近幾年來量子點(diǎn)分子信標(biāo)的發(fā)展進(jìn)行了綜述，其中針對(duì)量子點(diǎn)的制備系統(tǒng)闡述了可用于制備分子信標(biāo)的量子點(diǎn)類型、量子點(diǎn)與分子信標(biāo)連接的方式、量子點(diǎn)分子信標(biāo)猝滅劑的選擇及其表征。同時(shí)還詳細(xì)介紹了量子點(diǎn)分子信標(biāo)在多重SNP測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)等核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。

量子點(diǎn)；分子信標(biāo)；核酸檢測(cè)；制備

1996年，Tyagi和 Kramer[1]設(shè)計(jì)了一種可以特異性識(shí)別核酸序列的新型熒光探針——分子信標(biāo)（Molecular Beacon）。這種探針是由寡核苷酸形成的發(fā)夾型分子，它包括一個(gè)環(huán)-莖結(jié)構(gòu)。其中環(huán)由與靶分子互補(bǔ)的核酸堿基序列組成，一般有 15～20個(gè)堿基；莖為兩列互補(bǔ)的堿基序列，一般是 5～7個(gè)堿基對(duì)。分子信標(biāo)5＇端帶有熒光基團(tuán)，3＇端帶有猝滅基團(tuán)。沒有靶分子時(shí)，分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)距離很近，熒光基團(tuán)不發(fā)光；當(dāng)分子信標(biāo)與序列互補(bǔ)的靶分子結(jié)合時(shí)，環(huán)與靶序列發(fā)生雜交，莖部分被打開，使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，從而恢復(fù)熒光。分子信標(biāo)具有特異性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，得到了很好的發(fā)展[2-4]。然而傳統(tǒng)的分子信標(biāo)使用的熒光基團(tuán)大都為有機(jī)熒光染料，其光漂白性和染料顏色的單一性，限制了分子信標(biāo)更為廣泛的應(yīng)用[5]。

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）又稱半導(dǎo)體納米晶體（semiconductor nanocrystal），是一種由Ⅱ～Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ～Ⅴ族（如InP、InAs等）元素組成，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米粒子[6]。量子點(diǎn)一般直徑為1～10 nm，由于限域效應(yīng)，其原有的連續(xù)能帶結(jié)構(gòu)發(fā)生分立、量子化，從而使其物理、化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)都產(chǎn)生了明顯的變化[6]。熒光量子點(diǎn)因其獨(dú)特的抗光降解、顏色可變、一元激發(fā)/多元發(fā)射及發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)等特性，可以彌補(bǔ)有機(jī)染料修飾的傳統(tǒng)探針的一些缺陷，所以被用來設(shè)計(jì)新型的分子信標(biāo)[7-9]。本文作者就將對(duì)量子點(diǎn)分子信標(biāo)的制備及其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用，尤其是近幾年的進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 量子點(diǎn)分子信標(biāo)的制備

1.1 用于制備分子信標(biāo)量子點(diǎn)的類型

在分子信標(biāo)中可以作為能量轉(zhuǎn)移信號(hào)供體的量子點(diǎn)一般為CdTe量子點(diǎn)[10-12]和ZnS-CdSe核殼量子點(diǎn)[13-14]。在密閉體系中，用高純氮?dú)饷撗?、保護(hù)，用巰基乙酸（TGA）作穩(wěn)定劑，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值，得到量子點(diǎn)前體溶液；加入新制備好的NaHTe到前體溶液中；在96 ℃水浴中回流2 h，即可得到尺度均一的水溶性CdTe[10]。ZnS-CdSe核殼量子點(diǎn)最早由Hines等報(bào)道[15]，由于量子點(diǎn)表面包覆一層 ZnS顯著提高了量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率。Dabbousi等[16]在此基礎(chǔ)上，將其制備好的單分散的CdSe納米顆粒表面包覆了一層ZnS，將其量子產(chǎn)率提高到30%～50%。這些量子點(diǎn)具有水溶性較好、制備方法成熟、性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，是制備量子點(diǎn)分子信標(biāo)的常用材料。

然而在比較苛刻的條件中（如pH值較低時(shí)），這些普通的量子點(diǎn)會(huì)變得不穩(wěn)定而影響其檢測(cè)效果。針對(duì)這一問題，研制了硅包裹量子點(diǎn)的分子信標(biāo)[17]。通過將傳統(tǒng)方法制備的三辛基氧膦修飾的ZnS-CdSe量子點(diǎn)與巰基乙醇反應(yīng)得到羥基修飾的量子點(diǎn)。純化后再與氨丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)得到氨基修飾的硅烷化量子點(diǎn)。將此產(chǎn)物進(jìn)一步與琥珀酰酐反應(yīng)便得到了羧基修飾的硅烷化量子點(diǎn)。與其它的硅量子點(diǎn)相比，它不但耐酸耐鹽，水溶性好，而且制備方法簡(jiǎn)單，不易聚集，更主要的是制成的量子點(diǎn)硅層薄，粒徑小，F(xiàn)?rster 距離合適，有利于能量轉(zhuǎn)移的形成，對(duì)于制備分子信標(biāo)十分有益。

另外還有研究報(bào)道以 Fe3O4為核層原料，以CdTe 量子點(diǎn)為殼層原料合成了 Fe3O4/CdTe 親水性磁性量子點(diǎn)[18]。再以Fe3O4/CdTe 作為能量供體、3′端修飾有淬滅劑BHQ-2的單鏈DNA作為能量受體合成分子信標(biāo)，成功構(gòu)建了熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系。用此方法所制備的探針可利用磁鐵將其與游離的DNA、BHQ-2 進(jìn)行快速分離。分子信標(biāo)中大多采用單光子-能量轉(zhuǎn)移，這種模式在生物檢測(cè)中，會(huì)受到其自身生物發(fā)光的干擾，背景較高。另外由于能量轉(zhuǎn)移中，很難有供體和受體的激發(fā)窗口完全不重合，所以直接激發(fā)供體時(shí)，受體常常也會(huì)被激發(fā)從而出現(xiàn)假陽(yáng)性。針對(duì)這樣的問題研究者們?cè)O(shè)計(jì)了雙光子-能量轉(zhuǎn)移。它可以在近紅外區(qū)域被激發(fā)，從而克服了以上的問題。此技術(shù)也被應(yīng)用到了量子點(diǎn)分子信標(biāo)技術(shù)中[19]。以水溶性ZnS-CdSe量子點(diǎn)為供體，以羅丹明染料（ROX）為受體制成的分子信標(biāo)，在波長(zhǎng)為800 nm的近紅外光區(qū)被激發(fā)時(shí)，不但避免了受體被激發(fā)也消除了生物體中自發(fā)熒光的干擾。

1.2 量子點(diǎn)與分子信標(biāo)DNA鏈的連接

在量子點(diǎn)分子信標(biāo)中最常用的連接方式是將羧基修飾的量子點(diǎn)與氨基修飾帶有猝滅基團(tuán)的分子信標(biāo) DNA鏈用交聯(lián)劑 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞氨鹽酸鹽（EDC）連接[12，20-21]。此方法容易操作，但由于反應(yīng)過程中需多步純化，使得連接產(chǎn)物穩(wěn)定性降低。另外連接到量子點(diǎn)上的生物分子的數(shù)量也不容易控制。因此有研究采用了鏈親和素修飾的量子點(diǎn)與生物素修飾帶有猝滅基團(tuán)的分子信標(biāo)DNA鏈的連接方法制備了量子點(diǎn)分子信標(biāo)[22]。這種連接方式具有很高的結(jié)合效率，并且熱穩(wěn)定性很好。Cady等[23]將這兩種連接方式進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)羧基連接的分子信標(biāo)與目標(biāo)信號(hào)雜交后，熒光信號(hào)恢復(fù)得更多。這是由于羧基連接分子信標(biāo)中量子點(diǎn)和猝滅基團(tuán)距離較小，能量轉(zhuǎn)移較強(qiáng)，猝滅得較徹底。進(jìn)而與互補(bǔ)DNA雜交后信號(hào)強(qiáng)度增大的就相對(duì)較多。除此以外，還有報(bào)道Medintz 等[24]利用一個(gè)具有巰基活性的組氨酸（6）連接片斷將量子點(diǎn)連接到分子信標(biāo)上。合成的組氨酸連接片斷純化后一端通過雙硫鍵與5′端巰基化的分子信標(biāo)DNA片段連接，另一端則通過金屬-組氨酸之間的作用自組裝到CdSe-ZnS核殼量子點(diǎn)上。這種自組裝的連接方式不但有很高的連接親和性而且可以控制連接的量子點(diǎn)上的DNA的量。以上說明，好的連接方式需具有組裝方便、產(chǎn)物穩(wěn)定以及可控的生物結(jié)合效價(jià)的特點(diǎn)。

1.3 猝滅劑的選擇

作為猝滅劑，基本要求是其吸收光譜要與能量轉(zhuǎn)移供體的發(fā)射光譜重合。由于二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）和黑洞猝滅劑（BHQ-2）對(duì)多種發(fā)射光譜不同的熒光基團(tuán)都有很好的淬滅作用，成為分子信標(biāo)通用的淬滅基團(tuán)[25-26]。在量子點(diǎn)分子信標(biāo)中，也經(jīng)常使用這兩種猝滅基團(tuán)[13，22，27]。此外也有報(bào)道采用Iowa black FQ作為量子點(diǎn)的能量轉(zhuǎn)移受體[17，23]。研究發(fā)現(xiàn)Iowa black標(biāo)記的分子信標(biāo)在與互補(bǔ)的 DNA鏈雜交后，熒光強(qiáng)度的恢復(fù)是DABSYL標(biāo)記的分子信標(biāo)的2倍。相比與這些有機(jī)染料，有很多研究發(fā)現(xiàn)納米金的猝滅效率更高，幾乎能接近 100%[22，28-31]。用納米金作為量子點(diǎn)分子信標(biāo)的猝滅基團(tuán)，不但猝滅效果好，而且可以延長(zhǎng)在活細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的檢測(cè)時(shí)間[14，23]。此外，由于納米金吸收光譜較寬可以作為各種發(fā)射波長(zhǎng)的QDs的通用受體，構(gòu)成理想的2D-A、3D-A 的FRET 體系，應(yīng)用于多組分分析[32-33]。Dong等[34]利用石墨烯作為量子點(diǎn)分子信標(biāo)的猝滅劑成功的檢測(cè)了目標(biāo)DNA。實(shí)驗(yàn)中沒有目標(biāo)DNA時(shí)，分子信標(biāo) DNA鏈與石墨烯的作用使得鏈上的量子點(diǎn)與石墨烯距離很近，因而被猝滅。當(dāng)有目標(biāo)DNA時(shí)，分子信標(biāo)DNA鏈與之雜交形成雙鏈后從石墨烯上釋放出來，這時(shí)量子點(diǎn)遠(yuǎn)離石墨烯，從而熒光得到恢復(fù)。這種新方法不但檢測(cè)靈敏度和特異性很高，而且無需在分子信標(biāo)上標(biāo)記猝滅基團(tuán)，減少了工作量。

1.4 量子點(diǎn)分子信標(biāo)的表征

在分子信標(biāo)探針中，猝滅效率是一個(gè)重要的參數(shù)，它可以用E=）來表示（R0為F?rster距離，即猝滅效率為50%時(shí)的距離，R為供體和受體之間的距離）[35]，也可用熒光劑的熒光發(fā)射光譜與淬滅劑的紫外吸收光譜的重疊范圍來直觀地表示[20]。在量子點(diǎn)分子信標(biāo)的制備中一般都會(huì)對(duì)此進(jìn)行考察[11，13，20，22]。此外，量子點(diǎn)分子信標(biāo)的性能還可以通過將其與完全互補(bǔ)、單堿基錯(cuò)配及完全不互補(bǔ)的DNA序列進(jìn)行雜交后熒光強(qiáng)度的恢復(fù)來考察它的特異性[13，22]。完全互補(bǔ)時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)；存在單堿基錯(cuò)配和完全不互補(bǔ)的目標(biāo)序列時(shí)，分子信標(biāo)的熒光信號(hào)則應(yīng)不能完全恢復(fù)。

文獻(xiàn)中也有利用凝膠電泳對(duì)合成的產(chǎn)物進(jìn)行表征[10，21]。由于在相同的電泳時(shí)間內(nèi)，電泳速率不同，分子信標(biāo)單鏈 DNA＞量子點(diǎn)分子信標(biāo)＞量子點(diǎn)，故可以將三者區(qū)分。進(jìn)而對(duì)合成的量子點(diǎn)分子信標(biāo)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，此法所用儀器簡(jiǎn)單，利于操作。然而由于使用電泳對(duì)分子信標(biāo)表征還存在重現(xiàn)性不好等的問題，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中還只是在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化時(shí)利用凝膠電泳進(jìn)行簡(jiǎn)單地考察[22，24，36]。

2 在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

量子點(diǎn)用于分子信標(biāo)檢測(cè)，克服了有機(jī)熒光染料的許多不足之處。對(duì)于普通的分子信標(biāo)可以進(jìn)行的核酸檢測(cè)工作，如PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)，單堿基突變檢測(cè)它都可以完成。此外由于量子點(diǎn)的一些獨(dú)特性質(zhì)，量子點(diǎn)分子信標(biāo)尤其適用于進(jìn)行多組分同時(shí)測(cè)定和體內(nèi)的檢測(cè)。

2.1 多重SNP檢測(cè)

通過改變量子點(diǎn)的組成或尺寸，可以使其發(fā)射可見光區(qū)任一波長(zhǎng)的光，也就是說它可以為吸收光譜在可見區(qū)的任一生色團(tuán)提供能量，并且保證了供體發(fā)射波長(zhǎng)與受體吸收波長(zhǎng)的良好重疊，增加了共振能量轉(zhuǎn)移，所以量子點(diǎn)分子信標(biāo)可用于多重SNP檢測(cè)。Li等[12]利用量子點(diǎn)分子信標(biāo)和毛細(xì)管電泳對(duì)兩重單堿基突變進(jìn)行了檢測(cè)。試驗(yàn)中，針對(duì)兩個(gè)突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了兩種不同顏色的量子點(diǎn)分子信標(biāo)。當(dāng)分子信標(biāo)與單堿基錯(cuò)配的突變型序列雜交反應(yīng)時(shí)，由于雜交反應(yīng)不能進(jìn)行，電泳圖上只會(huì)出現(xiàn)量子點(diǎn)分子信標(biāo)的信號(hào)峰。如果與完全互補(bǔ)的野生型序列雜交反應(yīng)時(shí)，則電泳圖上除了量子點(diǎn)分子信標(biāo)的信號(hào)峰還會(huì)在遷移時(shí)間較短的地方出現(xiàn)分子信標(biāo)與互補(bǔ)序列雜交產(chǎn)物的信號(hào)峰。并且由于分子信標(biāo)被打開，此峰的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)增大。因此當(dāng)電泳圖上出現(xiàn)4個(gè)峰時(shí)則兩個(gè)被測(cè)物均為野生型；3個(gè)峰則一個(gè)被測(cè)物為野生型，一個(gè)為突變型；2個(gè)峰則均為突變型。此方法靈敏度和特異性都很好，另外由于采用了毛細(xì)管電泳，可以有效將雜交后的分子信標(biāo)和沒有雜交的分子信標(biāo)分離，從而避免了假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

2.2 細(xì)胞內(nèi)病毒基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)

在生物檢測(cè)中，活體細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，特別是病毒基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)得到越來越多的重視和應(yīng)用。如Jerome等[37]考察了流感、托高土、Borna病的負(fù)鏈RNA病毒在細(xì)胞核內(nèi)外的運(yùn)輸過程，Duprex等[38]利用綠色熒光蛋白研究了麻疹病毒在細(xì)胞間的傳遞過程，以及M cDonald等[39]利用加強(qiáng)綠色熒光蛋白檢測(cè)HIV在感染細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。近年來也有報(bào)道利用羧基熒光素標(biāo)記的分子信標(biāo)對(duì)HAV感染的FRhK-4 細(xì)胞的進(jìn)行檢測(cè)[40]。在這些眾多的檢測(cè)方法中，分子信標(biāo)由于特異性高、背景低成為了最有前途的技術(shù)。然而傳統(tǒng)的分子信標(biāo)耐光漂白性較差，不利于長(zhǎng)時(shí)間的監(jiān)測(cè)，其應(yīng)用也得到了一定限制。相比而言，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度和耐光降解都大大增加（大約100倍），從而更加有利于活細(xì)胞內(nèi)的病毒檢測(cè)[41]。Yeh等[14]利用量子點(diǎn)-納米金分子信標(biāo)檢測(cè)了布法羅綠猴腎細(xì)胞中科薩基病毒。實(shí)驗(yàn)中不但對(duì)病毒進(jìn)行了定量分析，還在熒光顯微鏡下對(duì)病毒的復(fù)制做了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)顯示，在細(xì)胞被病毒感染1 h后即觀測(cè)到量子點(diǎn)的熒光信號(hào)。隨著時(shí)間的推移，熒光信號(hào)越來越強(qiáng)，表明病毒RNA正在不斷的合成和聚集。從6 h后直到12 h，量子點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)一步的向外擴(kuò)散，正顯示了子代病毒對(duì)細(xì)胞的再度感染。由此，量子點(diǎn)分子信標(biāo)的應(yīng)用有利于對(duì)病毒寄主的相互作用和發(fā)病機(jī)理的進(jìn)一步研究。

2.3 細(xì)菌內(nèi)基因的檢測(cè)

量子點(diǎn)分子信標(biāo)由于靈敏度高、特異性好，還可用于微小的細(xì)菌內(nèi)的檢測(cè)。有研究報(bào)道采用量子點(diǎn)分子信標(biāo)原位雜交的方法對(duì)大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)[27]。與之前工作中傳統(tǒng)的原位雜交方法相比[42]，由于分子信標(biāo)在無目標(biāo) DNA時(shí)不會(huì)打開其莖環(huán)結(jié)構(gòu)，因此即使在細(xì)菌細(xì)胞膜甚至在細(xì)胞質(zhì)中存有分子信標(biāo)探針也不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。同時(shí)由于分子信標(biāo)與目的基因雜交后無需進(jìn)行洗脫等繁瑣步驟，從而實(shí)現(xiàn)了一步原位雜交檢測(cè)法。另外量子點(diǎn)分子信標(biāo)在對(duì)目的pUC18基因的特異性結(jié)合和背景噪聲的消除中都顯示出了很大的優(yōu)越性。因此量子點(diǎn)分子信標(biāo)將有望成為耐藥菌檢測(cè)的有效生物探針。

3 結(jié) 語(yǔ)

分子信標(biāo)特異性高且無需分離，在核酸檢測(cè)中有著很廣泛的應(yīng)用。然而其熒光效率卻受限于其閉合形式時(shí)不能完全猝滅；打開形式時(shí)只有一個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)光信號(hào)。因此研究者們研究了很多方法來提高其信噪比。如設(shè)計(jì)in-stem 分子信標(biāo)[43]、引入多個(gè)熒光或猝滅基團(tuán)[44]或利用共軛聚合物作為發(fā)光基團(tuán)[45]以及采用受激準(zhǔn)分子發(fā)射[46-47]、電化學(xué)發(fā)光[48]等方法。量子點(diǎn)具有熒光強(qiáng)度高的特點(diǎn)，使用在分子信標(biāo)中與靶分子結(jié)合后，體系中熒光增強(qiáng)的倍數(shù)比傳統(tǒng)熒光試劑要高，所以檢測(cè)靈敏度也顯著提高[31]。此外，用量子點(diǎn)制備分子信標(biāo)還具有抗光漂白、可多重檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。相信隨著各種新型量子點(diǎn)的出現(xiàn)以及連接、猝滅方式的優(yōu)化，量子點(diǎn)分子信標(biāo)必將在基因和醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面有更多的應(yīng)用。

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Preparation of quantum dot-molecular beacon and its application in nucleic acid detection

JIA Huning，YE Baofen，YAN Zhengyu
（Department of Analytical Chem istry，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

Quantum dots（QDs） have substantial advantages over organic dyes，including high stability against photobleaching，tunable colors by changing particle size，a single wavelength for simultaneous excitation of different-sized QDs and narrow emission peaks. Replacing the organic fluorophores of the conventional molecular beacon w ith QDs w ill overcome its many shortcomings. Quantum dot-molecular beacon is not only sensitive in measurement and stable against photo degradation，but also can be applied for multi-detection. In this paper，the development of quantum dot-molecular beacon in recent years is introduced. The types of MBs，linkage strategies，fluorescence quenchers and the characterization of quantum dot-molecular beacon were summarized. Moreover，its applications on nucleic-acid diagnostics are discussed，including multiple SNP detection，real-time monitoring on the living cells.

quantum dots；molecular beacon；nucleic acid detection；preparation

TB 3

A

1000–6613（2012）05–1071–05

2011-10-25；修改稿日期：2011-11-28。

中國(guó)藥科大學(xué)青年教師基金。

賈滬寧（1978—），女，講師。E-mail jiahuning@sina.com。聯(lián)系人：嚴(yán)拯宇，教授，博士生導(dǎo)師。