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    淫羊藿總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用*

    2014-01-23 03:43:50楊鈞杰潘定一唐文濤許可佳齊敏友
    關(guān)鍵詞:腎小管黃酮腎臟

    錢 虹,楊鈞杰,潘定一,唐文濤,許可佳,齊敏友

    糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是糖尿病嚴(yán)重而常見的慢性并發(fā)癥,同時(shí)也是糖尿病患者中最常見的微血管病變之一[1]。大量研究表明:血流動(dòng)力學(xué)途徑、纖維化和炎癥因子、激酶途徑以及氧化應(yīng)激介質(zhì)等在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[2],其中纖維化因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)受到廣泛關(guān)注[3]。淫羊藿總黃酮(total flavonoids of epimedium,TFE)是從淫羊藿莖葉中提取的黃酮類成分,是淫羊藿的主要有效成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,TFE對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等疾病均有一定作用[4],同時(shí)也表現(xiàn)出較好的降血糖作用,但 TFE在DN發(fā)展過程中是否可以通過抑制腎臟TGF-β1蛋白表達(dá)從而抗腎臟纖維化尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)建立糖尿病大鼠腎病模型,研究TFE對(duì)糖尿病大鼠腎病的作用及其機(jī)制,為其臨床新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 SD大鼠,體重180~200 g,由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙)-2008-0033。

    1.1.2 藥物與主要試劑 淫羊藿總黃酮由西安小草植物科技有限公司提供;鏈脲佐菌素,由Sigma公司生產(chǎn);SOD、MDA、BUN、Cr、考馬斯亮藍(lán)試劑盒,均由南京建成生物工程有限公司提供;兔抗大鼠TGF-β1抗體,由博士德生物技術(shù)有限公司提供;兔抗Envision抗體,由DAKO公司提供。

    1.1.3 儀器 血糖測(cè)試儀(美國(guó)強(qiáng)生);AL204型電子天平(Made by Mettler-Toledo Group);高速冷凍離心機(jī)(Biofuge stratos,德國(guó) Thermo);MICROM輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(HM325型,德國(guó)美康)。

    1.2 方法

    1.2.1 模型建立 雄性SD大鼠,分籠飼養(yǎng)。禁食不禁水12 h后,一次性尾靜脈注射 STZ(40 mg/mg),STZ以檸檬酸緩沖液溶解(pH 4.5),現(xiàn)配現(xiàn)用。72 h后,取尾靜脈血測(cè)血糖,兩次血糖均高于16.7mmol/L者視為糖尿病大鼠模型。大鼠隨機(jī)分為3組(n=10):對(duì)照組、模型組、TFE組。造模第 5周開始灌胃,TFE以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成混懸液,給藥劑量 100 mg/(kg·d),對(duì)照組與模型組給予相同體積的0.5%CMC-Na溶液,連續(xù)8周。

    1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 末次給藥后,空腹12 h,尾靜脈采血,血糖儀測(cè)定各組血糖。內(nèi)眥取血,靜置,4℃離心(3 500 r/min,10 min),取上清,按照試劑盒說明書測(cè)定血尿素氮和肌酐含量。處死大鼠,快速取出腎臟,剔除周圍結(jié)締組織和脂肪,生理鹽水洗凈,濾紙吸干后稱取腎臟質(zhì)量,根據(jù)末次體重計(jì)算腎臟臟器系數(shù)(腎臟重/體重)。取適量右側(cè)腎臟組織,冷生理鹽水冰浴條件下制成10%勻漿液,4℃離心(3 000 r/min,10 min),取上清液,-20℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)超氧化物歧酶(superoxide dismutase,SOD)活 性 和 丙 二 醛 (malondialdehyde,MDA)含量。

    1.2.3 組織學(xué)檢測(cè) 左側(cè)腎臟組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,經(jīng)Masson染色后于光鏡下觀察腎小球的病理改變和膠原纖維增生情況。

    1.2.4 免疫組化檢測(cè) 采用免疫組化 Envision法檢測(cè)TGF-β1在各組大鼠腎組織的分布和表達(dá),DAB顯色,蘇木素復(fù)染。TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)半定量方法參考本實(shí)驗(yàn)室前期的研究[5],取 10個(gè)視野點(diǎn)(100倍),取均值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,并作組間倆倆比較。

    2 結(jié)果

    2.1 淫羊藿總黃酮對(duì)糖尿病大鼠一般體征和腎臟臟器系數(shù)的影響

    對(duì)照組大鼠飲食及尿量正常,精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,毛色潔白有光澤,體重穩(wěn)定增加。模型組大鼠表現(xiàn)為多飲、多食、多尿癥狀,體重逐漸減輕,腎臟臟器系數(shù)顯著增大(P<0.01)。TFE組大鼠一般體征與對(duì)照組接近,腎臟系數(shù)得到改善(P<0.01,表1)。

    Tab.1 Body weight,ratio of kidney/body weight improved after interventions with TFE for 8 weeks(ˉx±s,n=10)

    2.2 淫羊藿總黃酮對(duì)大鼠血糖和腎功能BUN、Cr的影響

    模型組大鼠血糖、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)水平較對(duì)照組均顯著升高(P<0.01),TFE組血糖略有下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),BUN和 Cr含量明顯低于模型組(P<0.05,表2),表明淫羊藿總黃酮對(duì)糖尿病腎功能有明顯改善作用。

    Tab.2 Comparison of blood glucose,BUN and Cr(ˉx±s,n=10)

    2.3 淫羊藿總黃酮對(duì)糖尿病大鼠腎組織SOD活力和MDA含量的影響

    與對(duì)照組相比,模型組大鼠腎組織中SOD活力顯著降低(P<0.01),MDA含量顯著升高(P<0.01),表明大鼠腎組織中存在過度的氧自由基,機(jī)體抗氧化能力下降。TFE組上述狀況得以改善(P<0.05,P<0.01,表 3),提示淫羊藿總黃酮某種程度上能夠提高機(jī)體的抗氧化能力。

    Tab.3 Comparison of SOD and MDA(ˉx±s,n=10)

    2.4 Masson染色法觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)

    Masson圖像染色光鏡下可見,對(duì)照組腎小管細(xì)胞排列整齊,僅可見少量膠原纖維分布。模型組腎小管細(xì)胞排列紊亂,腎小管-間質(zhì)細(xì)胞之間、血管周圍膠原纖維顯著增多,分布紊亂呈藍(lán)色。TFE組較模型組有所改善,膠原纖維分布正常,血管周圍、腎小管-間質(zhì)細(xì)胞間僅有少量淺藍(lán)色著色(圖1)。

    Fig.1 Expression of collagen protein in renal tissue of rats(Masson×100)A:Control group;B:Modelgroup;C:TFE group;TFE:Total flavonoids of epimedium

    2.5 腎臟組織中TGF-β1表達(dá)的變化

    免疫組化結(jié)果顯示,對(duì)照組部分腎小管間質(zhì)僅有微量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)陽(yáng)性棕黃色顆粒;模型組(0.39±0.06)腎小管系膜區(qū)、基底膜可見大量棕褐色陽(yáng)性顆粒,呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),與對(duì)照組(0.16±0.03)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);TFE組(0.25±0.02)較腎小管間質(zhì) TGF-β1陽(yáng)性著色明顯減輕(P<0.01,圖 2)。

    Fig.2 Expression of TGF-β1 in renal tissuesof rats(Immunohistochemical×100)A:Control group;B:Model group;C:TFE group;TFE:Total flavonoids of epimedium**P<0.01 vs A;##P<0.01 vs B

    3 討論

    糖尿病腎病臨床表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率降低、蛋白尿、動(dòng)脈血壓升高、體液潴留等癥狀,最終導(dǎo)致腎功能衰竭,是糖尿病患者死亡的重要原因[6]。新近研究表明,DN源于高血糖下的代謝紊亂,導(dǎo)致纖維化因子和炎癥因子合成釋放增加、氧化應(yīng)激增強(qiáng)導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變[7]。本實(shí)驗(yàn)以STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型,腎功能降低,腎臟抗氧化能力減弱,Masson染色顯示腎臟結(jié)構(gòu)排列紊亂,腎小球和腎小管纖維化明顯,表明糖尿病腎病模型建立成功。TFE能夠提高糖尿病腎病大鼠腎組織抗氧化能力,減輕腎組織纖維化,對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為:糖尿病腎病乃糖尿病日久傷陰耗氣,使腎體受損,腎用失司所致[8]。治療上以補(bǔ)腎活血、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀等為主。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿的全草,是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中的一味補(bǔ)益中藥,具有滋陰補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨等功效,是中醫(yī)藥醫(yī)治DN的常用處方之一。TFE是從其莖葉中提取的主要有效成分,作為一種植物黃酮,具有較好的抗氧化活性,推測(cè)其能保護(hù)腎臟,延緩DN進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)觀察到TFE對(duì)糖尿病大鼠血清尿素氮和肌酐具有明顯的改善作用,表明其可保護(hù)糖尿病大鼠腎功能;此外,我們對(duì)大鼠腎組織中MDA含量和SOD活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)TFE治療,糖尿病大鼠腎組織中脂質(zhì)過氧化物含量明顯減少,抗氧化酶SOD活性有顯著提高,提示TFE能夠提高經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟抗氧化能力,降低氧化應(yīng)激水平,這與我們的推測(cè)相一致。此外,TFE組血糖較模型組并未有明顯降低,表明TFE可能是通過提高抗氧化能力而不是通過降低血糖保護(hù)糖尿病大鼠腎臟。

    腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)進(jìn)行性積聚是DN的重要特征,也是腎小球硬化、腎小管壞死和腎功能衰竭的關(guān)鍵[9]。在這一過程中,TGF-β1參與并發(fā)揮重要作用,其通過破壞ECM的合成與降解平衡造成ECM過度積聚。一方面,TGF-β1可上調(diào)纖溶酶原激活物抑制物-1(plaminogen activator inhibitor-1,PAI-1)表達(dá),從而抑制纖溶酶原激活物對(duì)纖溶酶原的活化,進(jìn)而使ECM降解減少。另一方面,TGF-β1可直接促進(jìn)腎小管細(xì)胞、系膜細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞合成膠原Ⅰ、層粘連蛋白和纖維連接蛋白[2],促進(jìn)ECM積聚;此外,TGF-β1也可上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),間接增加 ECM合成。兩方面共同作用,最終加劇DN病情。本實(shí)驗(yàn)Masson染色、TGF-β1免疫組化及半定量結(jié)果顯示,糖尿病大鼠經(jīng)TFE治療后,腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低,纖維化情況明顯得到改善,提示TFE可能通過上述機(jī)制減輕糖尿病腎臟損傷。

    綜上所述,高水平的氧化應(yīng)激和TGF-β1蛋白表達(dá)加劇DN過程,TFE能較好減輕DN引起的腎臟損傷,其可能機(jī)制包括增加機(jī)體抗氧化能力和下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)而不是通過降低血糖。由于目前對(duì)DN缺乏有效的治療手段,因此研究TFE保護(hù)DN大鼠腎臟的作用和機(jī)制,對(duì)開發(fā)中藥治療DN具有重要意義。

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