MTT法測(cè)定異搏定聯(lián)合化療藥物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251化療敏感性評(píng)估

何國(guó)龍 金許洪 尹 劍 馬躍輝 秦福創(chuàng) 葉 欣

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，是顱內(nèi)發(fā)病率最高、最難治愈的惡性腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的35% ～61%［1］。盡管有手術(shù)、化療和γ刀、X刀等治療方法，但預(yù)后依然不佳。從臨床治療效果看，術(shù)后輔助化療在膠質(zhì)瘤的綜合治療中的作用越來(lái)越受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法檢測(cè)不同時(shí)間和劑量的化療藥物對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U125存活度的變化，來(lái)探討異搏定分別聯(lián)合化療藥物(阿霉素、長(zhǎng)春新堿、足葉乙甙)在不同作用時(shí)間點(diǎn)和不同劑量的作用下對(duì)膠質(zhì)瘤化療敏感性的影響，進(jìn)一步明確化療敏感性的差異。

材料與方法

1.主要材料、試劑與儀器:U251細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，阿霉素、長(zhǎng)春新堿、足葉乙苷、異搏定購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;主要儀器包括:上海精密科學(xué)儀器有限公司紫外分光光度儀MC－756，美國(guó)SHELDON公司二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱TC2323等。

2.組別設(shè)置:一共4個(gè)組，第1～3組為實(shí)驗(yàn)組和第4組為對(duì)照組，具體見(jiàn)表1。

3.細(xì)胞培養(yǎng):將U251細(xì)胞置于pH 7.2～7.4的DEME培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青霉素100U/m l，鏈霉素100U/m l)中，待細(xì)胞狀態(tài)良好后進(jìn)行鋪板(96well);鋪板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/m l，每孔加100μl細(xì)胞懸液。在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24h，上藥，棄去原培養(yǎng)液，用培養(yǎng)基稀釋藥物，配制成不同濃度的藥物培養(yǎng)液，每孔100μl上藥;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)良好無(wú)退化，待其鋪滿瓶壁70%～80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，隔夜換液。對(duì)照孔直接換培養(yǎng)基。分別在各時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、36、48、72h)檢測(cè)。

4.MTT法檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，接種，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液，棄去上清液。設(shè)置對(duì)照組及異搏定聯(lián)合化療組(阿霉素、長(zhǎng)春新堿、足葉乙甙)時(shí)設(shè)置不同時(shí)間組(6、12、24、36、48、72h)觀察時(shí)效關(guān)系。孵育4h每孔加入10μl 5mg/ml的MTT液;37℃恒溫下孵育4h;棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，37℃振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解;待結(jié)晶充分溶解后置于酶標(biāo)儀上，測(cè)量各孔的光密度值 D值:測(cè)量波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)為630nm。計(jì)算不同藥物濃度的細(xì)胞存活度:細(xì)胞存活度(%) =實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對(duì)照組OD平均值×100%。檢測(cè)異博定對(duì)細(xì)胞存活率的影響。分析比較加異博定前后，異搏定對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

表1 不同劑量對(duì)化療敏感性影響的組別設(shè)置

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以百分?jǐn)?shù)(%)來(lái)表示。組間存活率的比較用χ2檢驗(yàn)。

結(jié)果

用MTT法檢測(cè)異搏定聯(lián)合化療藥物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251化療敏感性。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，用細(xì)胞存活率及不同藥物濃度的對(duì)數(shù)值制作圖(表2)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外，長(zhǎng)春新堿低濃度區(qū)域，加入異搏定后，細(xì)胞存活率也有下降，但不明顯。隨著化療時(shí)間的增加，細(xì)胞存活度在各組中均有減少，但在長(zhǎng)春新堿組減少的幅度最大，阿霉素組次之，而足葉乙苷組最少。異搏定聯(lián)合阿霉素組的濃度在0.3～60.0μg/ml，細(xì)胞存活度減少的幅度明顯大于其他濃度;異搏定聯(lián)合長(zhǎng)春新堿組、異搏定聯(lián)合足葉乙甙組在0.5～200.0μg/ml這段濃度時(shí)，存活度明顯減少，以長(zhǎng)春新堿組減少最為明顯。72h時(shí)間點(diǎn)，阿霉素組細(xì)胞存活率為35.72%，長(zhǎng)春新堿組細(xì)胞存活率為16.37%，足葉乙苷組細(xì)胞存活率為61.72%，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05(表3)。不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞存活率在各組中均有減少，但在長(zhǎng)春新堿組減少的幅度最大，阿霉素組次之，而足葉乙甙組最少。

表2 各化療組不同藥物濃度時(shí)細(xì)胞存活率的比較

表3 各化療組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率的比較

討論

體外化療藥物敏感試驗(yàn)方法頗多，常用的有集落形成分析法、集落形成效率法、放射核素標(biāo)記前體物抑制試驗(yàn)，多細(xì)胞腫瘤球體形成試驗(yàn)及MTT法，而MTT法已應(yīng)用于各種腫瘤細(xì)胞系所代表的化療藥物的藥物敏感性的篩選。有報(bào)道體外MTT與患者自體內(nèi)的敏感性具有高度相關(guān)性［2］。對(duì)于腦膠質(zhì)瘤術(shù)后化療敏感性差的原因，除了化療藥物的血腦屏障通透性和多重耐藥基因的誘導(dǎo)表達(dá)所引起外，未能針對(duì)腫瘤類(lèi)型及個(gè)體選擇敏感性藥物進(jìn)行化療也是一個(gè)重要原因［3］。因此，針對(duì)膠質(zhì)瘤對(duì)不同化療藥物的敏感性，為每個(gè)患者制定個(gè)體化的化療方案，避免無(wú)效化療，減少不必要的不良反應(yīng)，提高化療效果十分必要［4］。

研究表明單一用藥療效差的原因是多方面的。聯(lián)合用藥時(shí)，尤其是異搏定聯(lián)合化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的打擊面增寬，可應(yīng)付多種不同的腫瘤細(xì)胞，并且還減少了耐藥性的發(fā)生率。更為重要的是，異搏定聯(lián)合化療藥物的劑量強(qiáng)度超過(guò)單一用藥。對(duì)化療具有一定敏感性的腫瘤來(lái)說(shuō)，有利于總療效的提高。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療敏感性與化療濃度及時(shí)間存在一定的關(guān)系，并且聯(lián)合化療的效果比單獨(dú)化療好［5］。于朝春等［6］根據(jù)化療藥物敏感性對(duì)腫瘤患者進(jìn)行個(gè)體化化療，認(rèn)為應(yīng)用藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)化療有助于改善患者的生存狀態(tài)，降低復(fù)發(fā)率和病死率，提高生存率。張偉等［7］利用MTT法對(duì)69例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行化療藥物敏感性測(cè)定，認(rèn)為同一藥物及同一個(gè)體的膠質(zhì)瘤標(biāo)本對(duì)不同藥物的敏感性差異很大。我們通過(guò)異搏定分別聯(lián)合化療藥物(阿霉素、長(zhǎng)春新堿、足葉乙甙)在不同作用時(shí)間點(diǎn)和不同劑量的作用下對(duì)膠質(zhì)瘤化療敏感性的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著聯(lián)合化療藥物劑量的增加，化療時(shí)間的延長(zhǎng)，72h時(shí)間點(diǎn)，DOX組細(xì)胞存活率為34.57%，VCR組細(xì)胞存活率為13.44%，VP－16組細(xì)胞存活率為62.71%，長(zhǎng)春新堿組對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的存活率影響最明顯。同時(shí)，有研究表明，沒(méi)有一種藥物能夠抑制所有腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)［8，9］。我們的試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。DOX、VCR、VP－16等藥物為臨床抗膠質(zhì)瘤化療常用藥，但只有VP－16具有較高的敏感率(約62.71%)，而其他兩種藥物的敏感性均較低。說(shuō)明VP－16對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用較好。

此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)化療藥物作用時(shí)間與化療敏感性也存在著一定的聯(lián)系，但其內(nèi)在機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床療效相關(guān)性的資料表明，化療藥物體外敏感、體內(nèi)敏感有效的符合率為50%～70%［6］。而體外藥物敏感性試驗(yàn)，作為臨床病人臨床試驗(yàn)的前期研究或敏感度的預(yù)測(cè)，并制定個(gè)性化化療方案具有重要價(jià)值［10］。

1 Hargrave DR，Zacharoulis S.Pediatric CNS tumors:current treatment and future directions［J］.Expert Rev Neurother，2007，7(8):1029－1042

2 Hand CM，Vender JR，Black P.Chemotherapy in experimental brain tumor，partⅠ:invitro colorimetric MTT assay［J］.J Neurooncol，1998，36(1):1－6

3 Demeule M，Shedid D，Beaulieu E.Expression ofmultidrug－resistance P glycoprotein(p－gp)in human brain tumors［J］.Int JCancer，2001，93:62－66

4 Vanden BentMJ，HegiME，Stupp R.Recent developm entsin the use of chemotherapy in brain tumours［J］.Eur JCancer，2006，42(5): 582－588

5 祁紅，陳紅專(zhuān)，馮菊妹，等.地昔帕明單用和合用替尼泊苷對(duì)大鼠腦交織瘤C6細(xì)胞增殖的調(diào)控作用［J］.中國(guó)癌癥雜志，2000，10 (1):62－64

6 Nikkhah G，Tonn JC，Hoffmann O，etal.The MTT assay for chemosensitivity testing of human tumors of the central nervous system，partⅡ: evaluation of patient and drug－specific variable［J］.JNeuro Oncol，1992，13(1):13－24

7 張偉，江濤，袁芳，等.腦膠質(zhì)瘤組織培養(yǎng)化療藥物敏感性的研究［J］.中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志，2007，12(4):163－166

8 Rampling R，James A，Papanastassiou V.The present and future management ofmalignantbrain tumours:surgery，radiotherapy，chemotherapy［J］.JNeurol Neurosurg Psychiatry，2004，75 Suppl 2:1124－30

9 Grundy RG，Wilne SH，Robinson KJ.Primary postoperative chemotherapy without radiotherapy for treatment of brain tumours other than ependymoma in children under 3 years:results of the first UKCCSG/ SIOP CNS 9204 trial［J］.Eur JCancer，2010，46(1):120－133

10 Van den Bent MJ，Hegi ME，Stupp R.Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours［J］.Eur J Cancer，2006，42 (5):582－588