格列本脲人工抗原的合成與鑒定

劉 盼，鄭海濤，何計國

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

格列本脲人工抗原的合成與鑒定

劉 盼，鄭海濤，何計國*

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

目的：合成格列本脲人工抗原。方法：采用對氨基苯甲酸法制備半抗原，將半抗原分別與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通過碳二亞胺法偶聯(lián)制備免疫原(Gli-BSA)和包被原(Gli-OVA)，利用紫外掃描進行抗原的化學鑒定，通過免疫原免疫Balb/c小鼠，間接酶聯(lián)免疫吸附法測定抗血清進行生物鑒定。結(jié)果：制備了Gli-BSA、Gli-OVA的人工抗原，經(jīng)紫外光譜掃描，偶聯(lián)比分別為4:1和17.7:1。免疫小鼠后獲得抗血清的效價均達到32000以上，半抑制質(zhì)量濃度為10μg/mL。結(jié)論：成功合成了格列本脲人工抗原，并獲得了格列本脲抗體，為格列本脲的免疫學檢測方法進一步研究提供了實驗基礎(chǔ)。

格列本脲；半抗原；載體蛋白；完全抗原

格列本脲，又名優(yōu)降糖，作為第二代的磺酰脲類降糖西藥被廣泛用于糖尿病的治療?；酋ｋ孱愃幬锞哂写碳う录毎置谝葝u素、減輕胰島素抵抗，降低空腹和餐后血糖的作用，是目前治療非胰島素依賴型糖尿病最主要的口服降糖藥[1]。主要不良反應(yīng)有過敏反應(yīng)，胃腸反應(yīng)和低血糖反應(yīng)，年老體弱和肝腎功能不全者易發(fā)生低血糖反應(yīng)造成昏迷與死亡。死亡率可達11%，不可逆腦損傷可達5%[2-3]。作為一種處方藥，使用時有其嚴格的劑量與時間要求，而由于格列本脲較好的降糖效果和低廉的價格，常被商家非法添加到保健食品和中成藥中，對消費者的身體健康產(chǎn)生不良影響，因此有必要開發(fā)一種快速有效的檢測方法?，F(xiàn)有檢測方法主要為：薄層色譜法[4-5]、液相色譜法[6-7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8-9]

等。薄層色譜法只能進行定性檢測，且假陽性率高，其他方法則前處理復雜、煩瑣耗時、儀器價格昂貴，且不適宜于現(xiàn)場檢測。近年來，免疫分析技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留分析和摻偽食品鑒定領(lǐng)域，以其簡單、廉價、快捷、靈敏度高、適用于大批量樣品檢測等優(yōu)點而成為一種重要的分析方法。目前尚未見格列本脲的免疫化學檢驗方法及產(chǎn)品的報道，因此本實驗進行了格列本脲免疫原的和包被原合成，為格列本脲單克隆抗體的制備和檢驗試劑的研發(fā)提供研究試材。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格列本脲(99%) Afla(天津)有限公司。

6周齡雌性Balb/c小鼠8只，20g/只，SPF級，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

對氨基苯甲酸 天津市精細化工研究所；N- 羥基琥珀酰亞胺(NHS) 德國Merck-Schuehardt公司；對乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)(化學純) 國藥集團化學試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙二胺(EDA)、硼酸、鹽酸、亞硝酸鈉(化學純) 北京化學試劑公司；牛血清白蛋白(BSA)第五組分(含量＞98.0%)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；薄層色譜硅膠預制板 煙臺市化學工業(yè)研究所；Tween-20(純度＞98.0%) 美國Fluka公司；0.01mol/L pH7.4的PBS溶液(磷酸緩沖液)、考馬斯亮藍染液、包被緩沖液(0.05mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液)、封閉液(含1%明膠的0.05mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液)、洗滌液PBST(含0.05% Tween-20的0.01mol/L，pH7.4的PBS)、底物緩沖液(pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)、底物TMB(2mg/mL DMSO)、終止液(2mol/L H2SO4)均為實驗室配制。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004 電子分析天平 北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司；722S 分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2450 紫外-可見分光光度計 日本島津分析儀器公司；Alpha-Pure 純水系統(tǒng) 上海瑞楓生物科技有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；JB21磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器；ROTINA35 臺式離心機 德國Hettich公司；透析袋(分子質(zhì)量12000～14000D)北京拜爾迪有限公司。

1.3 抗原合成

1.3.1 半抗原的合成

1.3.1.1 格列本脲的脫甲基化[10]

試劑與條件：BBr3，CH2Cl2，溫度0℃后逐漸至室溫，時間為2d，按圖1的合成路線委托其他實驗室合成。

圖1 格列本脲衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route of glibenclamide derivatives

1.3.1.2 半抗原的合成[11]

稱取20mg(145μmol)對氨基苯甲酸(Mr＝137)溶于2.2mL 0.2mol/L的HCl，0～4℃攪拌，得到A液。將12mg (174μmol)NaNO2溶于0.35mL蒸餾水，得到B液。將B液逐滴加入A液中，避光攪拌反應(yīng)1h，得到C液，溶液略帶微黃色。稱取30.1mg(62.7μmol)格列本脲衍生物，溶于600μL DMF，再加入10mL 4℃的0.05mol/L硼砂緩沖液(pH8.5，含0.15mol/L NaCl)，0～4℃攪拌、反應(yīng)，得到D液。將1.5mL C液加入到D液中，避光反應(yīng)2h。加H3BO3晶體調(diào)節(jié)pH值至7.4，得到半抗原。

通過薄層層析法和質(zhì)譜法進行半抗原合成的鑒定。合成路線見圖2。

圖2 格列本脲半抗原的合成路線Fig.2 Synthetic route of glibenclamide hapten

1.3.2 完全抗原的合成

免疫原(Gli-BSA)的合成采用牛血清白蛋白(BSA)為載體。先活化BSA蛋白得到cBSA。

cBSA的制備[10]：將18mg(300μmol) EDA慢慢滴入4℃的20mL(0.01mol/L pH7.4)磷酸鹽緩沖液PBS中，0～4℃攪拌，向該溶液中逐滴加入濃鹽酸，調(diào)pH值至7.4；稱取1g BSA(15 μ mol)和56mg (300 μ mol)EDC加入上述EDA的溶液中，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后，反應(yīng)液用玻砂漏斗抽濾，取上清液透析以除去多余的EDA。用PBS (0.01mol/L pH7.4)緩沖液0～4℃透析5d，每8h更換一次透析液。將透析后的溶液凍干，得白色絮狀固體，-20℃保存。

免疫原的合成[12]：加入136mg(2μmol)的cBSA，隨后加入120mg(626μmol)EDC，36mg(313μmol)的NHS，室溫攪拌3 h。得到酒紅色反應(yīng)液(合成的目標產(chǎn)物Mr=628.1)。用PBS(0.01mol/L，pH7.4)0～4℃透析3d，每8h更換一次透析液。

另以卵清蛋白(OVA)為載體蛋白，同法合成包被原(Gli-OVA)。

通過考馬斯亮藍G-250法測定合成抗原的蛋白濃度，紫外(200～400nm)掃描測定偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比的計算方法[13]：

式中：A330nm為抗原在小分子最大吸收波長處(330nm)的吸光度；為BSA在其最大吸收波長處(278nm)的吸光度；為BSA在小分子最大吸收波長處(330nm)的吸光度；為小分子在其最大吸收波長處(330nm)的吸光度；為小分子在BSA最大吸收波長處的吸光度；A278nm為偶聯(lián)物在BSA最大吸收波長處的吸光度；C1為小分子標準物濃度(mol/L)；C2為BSA標準物濃度(mol/L)。

Gli-OVA偶聯(lián)物鑒定方法同上。

1.4 動物免疫

選取8只6周齡的Balb/c雌性小鼠，兩只用作陰性對照，另外6只用免疫原BSA-Gli進行免疫。免疫劑量為100μg/只，首次免疫采用等量弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射，以后每兩周免疫一次，采用等量弗氏不完全佐劑乳化后注射。第3次免疫后7d對小鼠進行眼眶采血約0.1mL/只，室溫靜置1h，再置4℃冰箱過夜，4000r/min離心10min，收集血清，-20℃保存。采用間接ELISA方法[14]，用Gli-OVA作為包被原測定免疫小鼠的抗血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成

通過重氮化反應(yīng)，將對氨基苯甲酸以氮氮雙鍵連接于格列本脲的苯環(huán)上，采用薄層層析法和質(zhì)譜法進行產(chǎn)物鑒定。

2.1.1 薄層色譜鑒定

薄層色譜法[15](展開劑：氯仿、環(huán)己烷、乙醇、冰醋酸體積比8:13:1:1)，結(jié)果顯示，在硅膠板上Rf為0.74處出現(xiàn)新的展開點(脫甲基格列本脲的Rf為0.86、對氨基苯甲酸的Rf為0.57)，表明反應(yīng)產(chǎn)生了不同于格列本脲衍生物和對氨基苯甲酸的物質(zhì)，說明發(fā)生了重氮化反應(yīng)并產(chǎn)生了新物質(zhì)。

2.1.2 質(zhì)譜鑒定

圖3 格列本脲半抗原的質(zhì)譜鑒定圖Fig.3 Mass spectrum of glibenclamide hapten

由圖3可見，反應(yīng)物中存在m/z為650.1的質(zhì)譜峰，由于本次質(zhì)譜為加鈉的分子離子峰[M+Na-H]，因此650.1的質(zhì)譜峰表明生成了相對分子質(zhì)量為628.10(650.1-23+1)的產(chǎn)物，該產(chǎn)物相對分子質(zhì)量與目標產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量628.15一致，結(jié)合反應(yīng)路線，可以推斷合成產(chǎn)物即為所需的目標半抗原，說明該合成路線可以用于格列本脲半抗原的合成。同時可見，650.1的分子離子峰是最強峰，表明新產(chǎn)物為反應(yīng)體系中的主要物質(zhì)，說明反應(yīng)產(chǎn)物具備相對較高的純度。

2.2 完全抗原的制備

通過碳二亞胺法將半抗原的羧基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，分別制備免疫原和包被原，產(chǎn)物采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量，采用紫外掃描鑒定偶聯(lián)比。

2.2.1 完全抗原的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

用考馬斯亮藍G-250法[16]測定完全抗原的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以標準蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，以吸光度的相對百分數(shù)(%)為縱坐標做工作曲線，分別得到BSA的工作曲線方程為y=0.7295χ+0.0229，R2=0.9999；OVA的工作曲線方程為y=0.52χ-0.01，R2=0.9984。根據(jù)BSA、OVA的工作曲線計算Gli-BSA、Gli-OVA的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為8.1、4.6mg/mL。

2.2.2 完全抗原的鑒定及偶聯(lián)比

用紫外掃描檢測法測定兩種不同方法合成的人工抗原中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)情況。根據(jù)偶聯(lián)物中所測蛋白的質(zhì)量濃度，將載體蛋白及偶聯(lián)物均配制成0.2mg/mL，格列本脲衍生物配成0.02mg/mL，并將上述溶液在200～400nm掃描其紫外吸收，根據(jù)掃描圖譜進行偶聯(lián)產(chǎn)物的鑒定。

圖4 免疫原Gli-BSA的紫外掃描圖譜Fig.4 UV scanning spectrum of immunogen Gli-BSA

圖5 包被原Gli-OVA的紫外掃描圖譜Fig.5 UV scanning spectrum of coating antigen Gli-OVA

由圖4、5可見，偶聯(lián)物Gli-BSA/Gli-OVA與BSA/OVA在相同的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下，吸收曲線發(fā)生了改變，在Gli-OH的最大吸收范圍內(nèi)，吸光度增加，表明偶聯(lián)物的紫外吸收峰為蛋白質(zhì)和半抗原吸收峰的疊加，說明載體蛋白成功偶聯(lián)上了一定數(shù)目的小分子半抗原，生成了完全抗原，與BSA偶聯(lián)的可以作為免疫原，與OVA偶聯(lián)的可以作為包被原。

根據(jù)圖譜計算結(jié)果為免疫原Gli-BSA和包被原Gli-OVA的偶聯(lián)比分別是：4:1和17.7:1。

2.3 免疫效果的測定結(jié)果

用Gli-OVA作為包被原，用間接ELISA法測定免疫原Gli-BSA免疫小鼠3次后獲得的小鼠抗血清，效價均達到32000以上，半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為10μg/mL，說明合成的免疫原能夠刺激小鼠產(chǎn)生抗體，該抗體和格列本脲小分子具有一定的親和力，格列本脲小分子可以和包被原競爭該抗體，能夠制備間接競爭法測定格列本脲的測試試劑盒，并可以通過細胞融合制備單克隆抗體。

3 討 論

格列本脲相對分子質(zhì)量為494.01(＜1000)， 為小分子物質(zhì)，只有反應(yīng)原性而無免疫原性，不能誘導機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞，因而需要與大分子的載體蛋白偶聯(lián)，合成既有反應(yīng)原性又有免疫原性的人工全抗原[17]。

抗原合成有多種方法，都是要通過半抗原小分子上一定的官能團(如—COOH或—NH2)連接到載體蛋白上，沒有特征官能團的小分子則需先經(jīng)過衍生等分子修飾使其帶上可連接載體的官能團。因為格列本脲的分子結(jié)構(gòu)沒有可以偶聯(lián)載體蛋白的活性基團，本實驗選擇通過去甲基，使苯環(huán)上的甲氧基變成酚羥基，再通過酚羥基的鄰位反應(yīng)，用對氨基苯甲酸的重氮鹽取代酚羥基鄰位的氫，從而給格列本脲分子接上一個對氨基苯甲酸作為間隔臂，同時也提供了可接蛋白的活性基團—COOH。這個結(jié)構(gòu)完整的保留了格列本脲分子中可能的抗原決定簇部分磺酰脲基團和苯環(huán)上的雜原子氯。磺酰脲結(jié)構(gòu)是磺酰脲類降糖藥的共性結(jié)構(gòu)，如果產(chǎn)生了針對此部分的抗體，則可建立檢測整個磺酰脲類的ELISA檢測方法，具有重要意義。

采用了碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白相偶聯(lián)合成抗原，碳二亞胺作為一種脫水劑，可使小分子和蛋白載體間經(jīng)過羥氨縮合反應(yīng)連接，格列本脲半抗原的—COOH和載體蛋白分子的—NH2在碳二亞胺的脫水作用下連接。

免疫原的特異性不僅與偶聯(lián)物的分子及結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)，還與每個蛋白分子上偶聯(lián)的小分子的數(shù)目相關(guān)，因此在免疫前，測定人工抗原中載體上連接的小分子數(shù)目是非常重要的。通常每一載體上含有8～25個半抗原能得到效價較高的抗體[18]，也有研究認為，偶聯(lián)比為3:1～45:1時，免疫原性較強[19]。本研究用紫外吸收光度法測得免疫原和包被原偶聯(lián)比分別為4:1和17.7:1，在3:1～45:1的范圍內(nèi)，免疫小鼠的實驗結(jié)果顯示，三免后效價均達到32000以上，半抑制濃度達到10μg/mL，也間接說明了抗原合成成功，與趙肅清等[19]的報道一致。

4 結(jié) 論

通過對氨基苯甲酸法合成了格列本脲半抗原，碳二亞胺法成功合成了格列本脲免疫原和包被原，偶聯(lián)比分別為4:1和17.7:1，免疫小鼠效價均達32000以上，半抑制質(zhì)量濃度達到10μg/mL，可以用于下一步單克隆抗體的制備及免疫學快速檢測方法的建立。

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Synthesis and Identification of Artificial Antigen for Glibenclamide

LIU Pan，ZHENG Hai-tao，HE Ji-guo*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Objective: To synthesize artificial antigen for glibenclamide. Methods: Hapten was synthesized by diazo reaction with p-aminobenzoic acid, and conjugated separately with BSA (bovine serum albumin) and OVA (ovalbumin) by carbodiimide method. Immunogen and coating antigen were obtained and designated as Gli-BSA and Gli-OVA, respectively. The synthesized artificial antigens were identified by mass spectrometry and UV spectroscopy. The immunogen was used to immunize Balb/c mice and the generated anti-serum was analyzed by indirect ELISA. Results: Gli-BSA and Gli-OVA were successfully synthesized with a coupling ratio of 4:1 and 17.7:1, respectively. The anti-serum titers after the first, second and third immunization of Balb/c mice were all above 32000 and the IC50 was 10 μg/mL. Conclusion: Artificial antigens for glibenclamide has been successfully synthesized and anti-glibenclamide antibodies have been acquired. This study can provide a basis for further studies on immunological detection of glibenclamide.

glibenclamide；hapten；carrier protein；complete antigen

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0200-04

2011-03-22

劉盼(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品安全。E-mail：pingdiguo2137@yahoo.com.cn

*通信作者：何計國(1966—)，男，副教授，研究方向為功能食品以及食品安全檢測。E-mail：hejiguo0870@sina.com