濃香型白酒主要發(fā)酵產(chǎn)物生成與微生物類群的動(dòng)態(tài)變化

余有貴，羅 俊，熊 翔，楊志龍，肖庚成

(1.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng) 422000；

2.湖南湘窖酒業(yè)有限公司，湖南 邵陽(yáng) 422004)

濃香型白酒主要發(fā)酵產(chǎn)物生成與微生物類群的動(dòng)態(tài)變化

余有貴1，羅 俊2，熊 翔2，楊志龍2，肖庚成2

(1.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng) 422000；

2.湖南湘窖酒業(yè)有限公司，湖南 邵陽(yáng) 422004)

為了探索濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)變化趨勢(shì)，采用氣相色譜分析和常規(guī)分析的方法，跟蹤測(cè)定不同層次糧糟在不同發(fā)酵時(shí)間的主要代謝產(chǎn)物含量。研究表明：糟醅中乙醇、總酸、總酯含量與微量香味成分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性；下層糟醅中的產(chǎn)物相應(yīng)高于上層糟醅中產(chǎn)物；微生物類群數(shù)量的相對(duì)變化幅度為：酵母菌＞細(xì)菌＞霉菌；上層糟醅的霉菌、酵母菌與細(xì)菌的數(shù)量分別略高于其下層糟醅的霉菌、酵母菌與細(xì)菌數(shù)量。本研究初步揭示了濃香型白酒的發(fā)酵機(jī)理。

濃香型白酒；固態(tài)發(fā)酵；糟醅；代謝產(chǎn)物；微生物區(qū)系；動(dòng)態(tài)分析

濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖為基礎(chǔ)，發(fā)酵過(guò)程是棲息于窖池糟醅、窖泥的龐大微生物區(qū)系在糟醅固、液、氣三相界面復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過(guò)程，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物構(gòu)成了濃香型白酒特有的風(fēng)格[1]。濃香型白酒的產(chǎn)量約占中國(guó)白酒總產(chǎn)量的70%，由于不同地區(qū)的土壤、氣候條件等存在差異，釀酒微生物生長(zhǎng)、繁殖的生態(tài)環(huán)境也會(huì)跟著變化。盡管對(duì)提高濃香型白酒質(zhì)量方面的研究報(bào)道較多，但糧糟發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)形成的動(dòng)態(tài)變化研究少見(jiàn)[2-4]。

為了探索發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)變化趨勢(shì)、白酒質(zhì)量與組成成分之間的相互關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以湖南湘窖酒業(yè)有限公司釀酒車間正常發(fā)酵窖池為實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，跟蹤測(cè)定不同層次糧糟發(fā)酵過(guò)程中主要代謝產(chǎn)物的含量與主要微生物類群數(shù)量的變化，以便更好地指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)，提高白酒產(chǎn)品的產(chǎn)量與質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)窖池、取樣與培養(yǎng)基

酒醅：以湖南湘窖酒業(yè)有限公司生態(tài)工業(yè)園釀造一車間正常發(fā)酵窖池為實(shí)驗(yàn)窖池，在糧糟的一個(gè)發(fā)酵周期(60d)內(nèi)，用取樣器對(duì)指定位置的入窖糧糟的糟醅進(jìn)行定點(diǎn)跟蹤取樣(4～6月)，取樣的位置分別為窖池的上層和下層，上層距窖頂0.6m，下層距窖頂1.6m，取得的糧糟醅樣品裝入無(wú)菌袋中密封。

細(xì)菌分離培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)、酵母菌分離培養(yǎng)基(麥芽汁培養(yǎng)基) 杭州微生物試劑有限公司；霉菌分離培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基) 自制[5]。

1.2 儀器與設(shè)備

500mL全玻璃蒸餾器、酸堿滴定儀器 南京三愛(ài)玻璃儀器公司；DMA5000密度儀 奧地利安東帕(中國(guó))有限公司；GC-14c型氣相色譜 日本島津公司。

1.3 測(cè)定方法

乙醇體積分?jǐn)?shù)：采用密度測(cè)定法[5]。取100.0g新鮮糧糟樣品，加入300mL蒸餾水，用500mL全玻璃蒸餾器蒸餾，收集100mL前餾出液，采用密度儀測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)，并查表校正為20℃時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)，用%表示。

總酸含量：采用中和滴定法[6]，用mmol/100g表示?？傰ズ浚翰捎迷砘吹味ǚ╗6]，用mmol/100g表示。微量有機(jī)酸和酯含量：采用氣相色譜法。取100.0g新鮮糧糟樣品，加入300mL蒸餾水，用500mL全玻璃蒸餾器蒸餾，收集100mL前餾出液，采用氣相色譜法測(cè)定各有機(jī)酸和酯的含量[6]，用mg/100mL表示。

微生物總數(shù)：采用稀釋平板分離法，計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU)，用lg(CFU/g)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 糧糟發(fā)酵過(guò)程中酒精體積分?jǐn)?shù)的變化

圖1 糧糟發(fā)酵過(guò)程中酒精體積分?jǐn)?shù)的變化Fig.1 Changes in ethanol content of fermented grains during fermentation

從圖1可知，下層糟醅發(fā)酵過(guò)程中酒精體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)前期緩慢上升、中期快速升至高峰基本穩(wěn)定、后期緩慢下降的趨勢(shì)。由于入窖溫度低，前期糖化速度較慢，相應(yīng)地酵母菌發(fā)酵也慢，生成的酒精少；隨著發(fā)酵溫度的升高，酒醅進(jìn)入旺盛的酒精發(fā)酵階段，酒度逐漸增加，至15～20d左右達(dá)到最高值；后期的發(fā)酵溫度逐漸降低，酵母菌逐漸趨向衰老死亡，酒精的生成量趨于穩(wěn)定，但隨著細(xì)菌和其他微生物數(shù)量增加，酒精等醇類和各種酸類進(jìn)行緩慢而復(fù)雜的酯化作用，酒精體積分?jǐn)?shù)會(huì)稍有下降[7-8]。

下層糟醅較上層糟醅的酒精體積分?jǐn)?shù)高。一方面是因?yàn)樘幱诮殉叵虏旷膮捬醭潭雀哂谏喜旷?，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精早而多；另一方面，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，由于重力的作用，黃水將上部醅產(chǎn)生的酒精下沉擴(kuò)散到窖池下部醅中，盡管下層酒精雖因酯化作用等消耗，但上層的沉積所產(chǎn)生的效果更加明顯，所以下層醅后期一直呈緩慢上升趨勢(shì)。

2.2 糧糟發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

圖2 糧糟發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Fig.2 Changes in total acid content of fermented grains during fermentation

從圖2可知，下層糟醅總酸含量前期緩慢上升、中后期快速升高、后期有所下降。前期由于產(chǎn)酸微生物的代謝作用，產(chǎn)生一定量的酸類物質(zhì)，且微生物的生酸量要大于酯化減少的量，總酸含量增加；旺盛的酒精發(fā)酵階段之后，隨著細(xì)菌和其他微生物數(shù)量增加，厭氧代謝加快生酸，總酸含量會(huì)漸漸升高；到了后期微生物產(chǎn)酸作用減弱，酯化作用加強(qiáng)，酸的消耗量大于生成量，總酸含量下降[9]。

上層糧糟醅與下層糧糟醅的總酸含量整體變化趨勢(shì)相同，但下層糟醅總酸含量略高于上層糟醅的總酸含量，主要是發(fā)酵產(chǎn)生的黃水將上部醅產(chǎn)生的酸下沉擴(kuò)散到窖池下部醅中積累所致。

2.3 糧糟發(fā)酵過(guò)程中乙酸、丁酸與己酸含量的變化

圖3 糧糟發(fā)酵過(guò)程中3種酸含量的變化Fig.3 Changes in acetic acid, butyric acid and caproic acid contents of fermented grains during fermentation

從圖3可知，3種酸的變化與總酸度的變化趨勢(shì)基本相同；3種酸的含量大小依次為：乙酸＞己酸＞丁酸；且同一酸成分在上層糟醅和下層糟醅中相差不大。

圖4 糧糟發(fā)酵過(guò)程中總酯含量的變化Fig.4 Changes in total ester content of fermented grains during fermentation

2.4 糧糟發(fā)酵過(guò)程中總酯含量的變化從圖4可知，糟醅中總酯的含量一直在增加，前期變化較緩慢，而中期和后期增長(zhǎng)較快。由于前期以酒精發(fā)酵為主，酯化作用較弱，前期產(chǎn)酯少；隨著發(fā)酵進(jìn)行，細(xì)菌的生酸作用使酸度上升，酯化作用的底物(醇類和酸類)濃度增加，所以酯化反應(yīng)的正向反應(yīng)大于逆向反應(yīng)，所以發(fā)酵中期和后期的酯含量逐漸上升。下層糟醅較上層糟醅的總酯含量高。一方面是因?yàn)樵诮殉氐纳鷳B(tài)環(huán)境中，除下層糟醅中微生物酯化作用積累酯類物質(zhì)外，由于窖底泥厭氧功能菌多、代謝更旺盛，導(dǎo)致窖底泥產(chǎn)生的酯類等代謝產(chǎn)物不斷地進(jìn)入糟醅中，使窖池下部糟醅酯含量高；另一方面，發(fā)酵產(chǎn)生的黃水將上部醅產(chǎn)生的酯類物質(zhì)下沉擴(kuò)散到窖池下部醅中積累所致[1]。

2.5 糧糟發(fā)酵過(guò)程中3種酯類含量的變化

圖5 糧糟發(fā)酵過(guò)程中3種酯含量的變化Fig.5 Changes in ethyl acetate, ethyl lactate and ethyl caproate contents of fermented grains during fermentation

從圖5可知，糟醅中3種酯含量呈現(xiàn)前期緩慢上升、中后期快速上升、后期緩慢上升的趨勢(shì)。3種酯的含量大小依次為：乳酸乙酯＞己酸乙酯＞乙酸乙酯，其中乳酸乙酯的變化趨勢(shì)與總酯的變化趨勢(shì)具有相似性。在糧糟發(fā)酵的一個(gè)周期內(nèi)，由于固態(tài)配醅發(fā)酵帶入了上一輪次糟中的酸，在微生物生長(zhǎng)和主要進(jìn)行酒精發(fā)酵的前期和中期，進(jìn)行著緩慢的酯化反應(yīng)。隨著發(fā)酵進(jìn)入中后期，以產(chǎn)香為主的細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)，酯化反應(yīng)加快而呈上升趨勢(shì)。尤其是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸增多，乳酸乙酯的合成加快，它的含量幾乎在總酯中占有支配地位，使得其變化趨勢(shì)與總酯的變化趨勢(shì)具有較好的相似性。

同一酯成分含量為下層糟醅略高于上層糟醅，主要是黃水的沉降作用和棲息于窖泥中的功能菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不斷地進(jìn)入底部糟醅中所致，從而促進(jìn)了酒質(zhì)的提高。2.6 糧糟發(fā)酵過(guò)程中微生物類群的變化

表1 糧糟發(fā)酵過(guò)程中微生物類群的變化Table 1 Changes in microflora during fermentation

從表1可知，霉菌在糧糟入窖發(fā)酵第1周略有減少，第2周進(jìn)入低谷，第3周回升到104CFU/g左右，在以后的發(fā)酵過(guò)程中變化幅度較小；霉菌數(shù)量變化總體相對(duì)較小，其中上層糟醅的霉菌數(shù)略高于下層糟醅的霉菌數(shù)。酵母菌在糧糟入窖發(fā)酵第1周略有增加，第2～4周略有回落，第6周迅速下降進(jìn)入低谷103CFU/g左右，在以后的發(fā)酵過(guò)程中變化極??；酵母菌數(shù)量變化總體相對(duì)較大，其中上層糟醅的酵母菌數(shù)略高于下層糟醅的酵母菌數(shù)。細(xì)菌在糧糟入窖發(fā)酵第1周迅速增加，第2周略有增加，在以后的發(fā)酵過(guò)程中變化較??；細(xì)菌數(shù)量變化總體相對(duì)適中，其中上層糟醅的細(xì)菌數(shù)略高于下層糟醅的細(xì)菌數(shù)。

3 討 論

濃香型大曲酒的發(fā)酵過(guò)程在泥窖內(nèi)密封條件下進(jìn)行，大曲粉、窖泥、生產(chǎn)環(huán)境和工用器具等提供了糟醅中的微生物類群。在入窖前期，好氧和兼性好氧微生物(包括霉菌、酵母菌、好氧細(xì)菌)利用糟醅顆粒間形成的縫隙所含的稀薄空氣進(jìn)行繁殖，從而使相應(yīng)類群的數(shù)量增加。其中霉菌是糖化的動(dòng)力，能將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖；當(dāng)好氧微生物將窖內(nèi)氧氣消耗殆盡以后，酵母菌在無(wú)氧環(huán)境中將葡萄糖發(fā)酵生成酒精。因此，在糧糟入窖的前3周，霉菌和酵母菌協(xié)同作用下邊糖化邊發(fā)酵，進(jìn)入生成以酒精為主要代謝產(chǎn)物的主發(fā)酵期[10]。

有機(jī)酸是濃香型白酒的重要呈味物質(zhì)，在糟醅的發(fā)酵過(guò)程中，酸的種類與酸的生成途徑是多種多樣的，其中細(xì)菌的代謝活動(dòng)是窖內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)酸的主要途徑，如醋酸菌將霉菌代謝產(chǎn)生的葡萄糖發(fā)酵生成醋酸，醋酸菌還可將回酒入窖的酒精和發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的酒精氧化生成醋酸，乳酸菌同樣可將葡萄糖發(fā)酵生成乳酸，窖泥或酯化液中已酸菌利用淀粉、葡萄糖、乙酸或丁酸等進(jìn)行發(fā)酵合成己酸。因此，發(fā)酵的中后期糟醅中的有機(jī)酸會(huì)大量積累，但是，酸類物質(zhì)是酯類物質(zhì)生成的前體物質(zhì)，酯類的生成會(huì)消耗一部分醇和酸而降低糟醅中醇和酸的含量[1,11]。

酯類物質(zhì)是濃香型白酒的主要呈香呈味物質(zhì)，其中己酸乙酸、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯的含量與配比決定著濃香型白酒的質(zhì)量及風(fēng)格[6-7]。隨著發(fā)酵窖池中微生物代謝的進(jìn)行，積累了大量的有機(jī)酸和乙醇，在微生物所含酯酶的作用下通過(guò)一系列的生化反應(yīng)生成了乙酯類成分。因此，發(fā)酵的中后期既是生酸期又是酯化期，盡管醇、酸酯化作用緩慢，但通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵周期可提高糟醅中的酯類物質(zhì)含量。

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Dynamic Variation of Main Products and Microflora during the Fermentation of Luzhou-flavor Liquor

YU You-gui1，LUO Jun2，XIONG Xiang2，YANG Zhi-long2，XIAO Geng-cheng2
(1. Department of Biology and Chemical Engineering, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China；
2. Hunan Xiang Jiao Liquor Co. Ltd., Shaoyang 422004, China)

Main fermentation products in fermented grains were determined by GC and conventional analysis methods at different depth and time points in order to explore the fermentation process of Luzhou-flavor liquor. The results showed that ethanol, total acids, total esters and aroma components in fermented grains changed regularly in the whole process of fermentation. The main fermentation products in the lower fermented grains were higher than the counterparts in the upper fermented grains. The relative variation ranges in the numbers of different species of microbes decreased in the following order: yeast > bacteria ＞fungi. The numbers of mold, yeast and bacteria in the upper fermented grains were slightly higher than those in the lower fermented grains. This study preliminarily reveals the fermentation mechanism of Luzhou-flavor liquor.

Luzhou-flavor liquor；solid-state fermentation；fermented grains；metabolites；microflora；dynamic analyses

TS262.3

A

1002-6630(2012)01-0170-04

2011-09-30

邵陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(C1142；C1021)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009NK3120)

余有貴(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵技術(shù)與酶制劑的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。E-mail：yufly225@yahoo.com.cn